一、背景介绍

提起转录组测序，大家都很清楚，因为目前而言转录组数据几乎每个人都接触过，分析过。比如其简单的组装、定量、差异表达、共表达网络等等。当然除了常规的RNA数据之外，还有lncRNA测序数据、cirRNA测序数据等等。

今天不在跟大家说分析，跟大家聊聊RNA建库测序的事情。

我们知道对转录组测序存在两种方法：检测polyA和核糖体剔除。对于真核而言，通常利用种方法，而对于细菌，没有polyA，应该用第二种。

二、普通建库和链特异性建库

那么问题来了一般情况下这两种方式什么时候用呢？我这个问题问的不好。大家应该之后转录组测序存在常规测序和链特异性测序，其中链特异性测序是利用的核糖体剔除方法，主要的目的是可以检测ncRNA。

＊普通建库

（1）图片版

（2）文字版

提取样本总RNA。

用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA。若为物种的mRNA没有poly（A）则采用去除rRNA的方式。

a.磁珠表面包被了Oligo（dT）探针，能与mRNA的poly（A）特异性结合，从而将mRNA结合到磁珠上，最后用RNase free water洗脱。

b.使用Ribo-zero试剂盒去除rRNA。试剂盒中有带生物素标记的与rRNA互补的探针，这些探针可以与rRNA保守区结合，在另一种链青霉素标记的磁珠作用下，与rRNA互补的探针被吸附在磁珠表面，从而去除rRNA。

高温环境下，二价阳离子对mRNA打断。

加入六碱基随机引物合成条cDNA链。

合成第二条cDNA链。

末端修复、3’加A并连接测序接头。（为神马要单独加A碱基呢，因为接头多出来一个T碱基啦,可以通过加上的A碱基与接头相连。）

片段大小选择。

PCR扩增。

HiSeq测序。

＊连特异性建库

（1）图片版

（2）文字版

1.提取样本总RNA。

2.采用去rRNA的方式除去rRNA。

3.加入六碱基随机引物合成条cDNA链。

4.在合成第二条链时，用dUTP代替dTTP，因此第二条DNA链上布满了U位点（这步是重点哦）。

5.3’端加A，加接头。

6.使用USER酶，这种酶可在尿嘧啶位置上产生一个单核苷酸缺口，从而消化掉第二条链，只保留DNA条链。

7.PCR扩增。

8.HiSeq测序。

优势

链特异性建库与普通转录组建库方式相比可以可以准确区分转录本是来自于正义链还是反义链。

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