大家好呀！今天给大家介绍一篇2021年发表在Molecular Therapy Oncolytics上的文章。乳腺癌是全世界范围内女性最常见的癌症类型之一，三阴性乳腺癌（TNBC）占侵袭性乳腺癌的15%-20%。目前化疗和手术是治疗TNBC患者的主要手段。新辅助化疗（NAC）主要用于保乳手术和消除临床无症状微转移。然而，在接受NAC的TNBC患者中仅有50%能够达到完全缓解（pCR）和良好的无复发生存。本研究，作者对NAC有应答和无应答的TNBC患者的单细胞转录组数据进行分析，全面了解NAC耐药性有关的转录景观。

Transcriptional landscape associated with TNBC resistance to neoadjuvant chemotherapy revealed by single-cell RNA-seq

单细胞转录组揭示与TNBC新辅助化疗耐药有关的转录景观

摘要：

三阴性乳腺癌（TNBC）的新辅助化疗（NAC）耐药是目前一个主要的临床挑战，了解肿瘤异质性可以为了解耐药机制和潜在治疗靶点提供新的信息。本研究作者对NAC应答和无应答患者的单细胞转录组数据进行分析，了解单细胞水平上与TNBC的NAC耐药相关转录环境，揭示肿瘤异质性。根据迭代聚类，ICGC和UMAP算法对单细胞进行聚类，pre-NAC的基因特征主要与肺上皮细胞，乳腺细胞和髓系白血病母细胞的基因特征类似而post-NAC的基因特征主要与乳腺细胞和成纤维细胞的基因特征类似。这些基因特征与加强细胞运动，FOXM1，NOTCH1和MYC激活及抑制肿瘤坏死因子(TNF)和IFNG机制网络有关。此外，多因素生存分析鉴定到3-基因特征（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以准确预测RFS。在无反应组中沉默几个上调基因的功能上是会抑制MDA-MB-231和BT-549 TNBC模型的CFU并增强了对紫杉醇的敏感性。作者的研究揭示了与NAC耐药性有关的转录景观，鉴定到关键基因并揭示了其在TNBC中的预后和靶向治疗的潜力。

结果：

1.数据集的获取

从SRA数据库下载单细胞转录组数据，SRP114962。从SRA数据库下载360例TNBC患者的转录组数据，SRP157974。

2.单细胞转录组测序和ICGS揭示pre-NAC和post-NAC的TNBC肿瘤内异质性

为研究单细胞水平下TNBC的异质性，作者对pre-NAC和post-NAC后4例有应答和4例无应答患者单细胞转录组数据进行分析。pre-NAC的有应答组有719个细胞，无应答组有525个细胞，post-NAC的有应答组有894个细胞，无应答组有687个细胞，共鉴定到13个簇（A）。对pre-NAC和post-NAC组中每个细胞簇中的差异表达基因绘制聚类热图并进行GO富集分析（A）。其中C1和C12主要存在于pre-NAC和post-NAC组中，而C5主要存在于pre-NAC中，C31,C22和C14主要富集于有应答组中。UMAP分析共鉴定到13个簇（B），其中C1和C2与其他簇具有显著差异，与其他簇没有重叠。

3.有应答组和无应答组的单细胞转录组比较分期揭示基因表达和GO富集存在显著差异

聚类分析表明pre-NAC的有应答组和无应答组的单细胞在转录组水平具有显著差异（A）。在无应答组中，干扰素γ反应，基因表达和细胞死亡调控有关的GO term显著富集，而细胞分裂调控，对蛋白质刺激反应和血清素代谢过程有关的GO term富集程度较低。在有应答组中免疫反应显著富集。使用火山图展示有应答组和无应答组的差异表达基因（B）。作者对排名前10的上调基因和下调基因使用第二个数据集的pre-NAC的有应答组和无应答组的单细胞数据进行验证（C和2D）。

4.IPA揭示了有应答组和无应答组显著差异的功能和通路

为进一步了解有应答组和无应答组富集的生物学通路，作者对上调基因进行IPA分析。在无应答组中富集程度最高的20条通路如A所示，主要涉及细胞器发育和细胞功能通路，包括增殖，迁移和入侵，氧化磷酸化，糖酵解，糖异生和胆固醇生物合成等。而应答组中排名前20的下调通路主要参与树突状细胞成熟，T细胞信号通路，免疫应答和BAG2信号通路等（B）。应答组中富集程度最高的功能主要为系统生长和细胞增殖（C）。为进一步研究上游调控因子的下游功能，作者对无应答组中上调基因使用IPA进行分析。构建的网络鉴定到7个上游调控因子，35个位于中间层次的基因（D）。

5.有反应组的免疫浸润细胞差异

使用IPA分析应答组的富集基因集，主要涉及免疫细胞转运和细胞间信号相互作用（A）。对pre-NAC和pre-NAC的应答组和无应答组的单细胞转录组数据进行分析，在应答组中CD19,CD8A,CD4,CD52,CD2,CD53,CD59,CD47,CD74和CXCL9的表达水平更高（B）。在post-NAC的应答组中CD74+细胞的数量较多（B）。为鉴定免疫渗透细胞在应答组和无应答组中是否存在功能差异，作者对CD45+EPCAM细胞的转录组进行IPA分析，结果表明应答组的免疫细胞功能较强，表明无应答组的免疫浸润细胞功能受损（C和4D）。

6.应答组和无应答组的基因与TNBC患者的生存的相关性

对应答组和无应答组进行差异分析鉴定到788个上调基因和244个下调基因（）。对360例TNCB患者的转录组数据中应答组和无应答组的差异基因进行单因素生存分析，其中无应答组中的上调基因与RFS较差有关（A），而应答组中的上调基因与预后较好有关（B）。随后，作者进行多因素Cox回归分析，鉴定到3-基因模型（KIF5BhighHLA-ClowIGHG2low）可以准确预测RFS（C）。3-基因模型的预测性能优于一些临床特征，例如肿瘤大小，年龄，亚型和治疗方式等（表1）。

7.靶向消除无应答组驱动基因会降低TNBC的形成和增强PTX敏感性

为研究驱动基因的机制和他们对PTX敏感性的作用，作者基于差异分析和通路分析选择了10个基因进行进一步分析。使用782个应答组和535个无应答组的单细胞转录组数据验证10个上调基因的表达水平（A）。使用CCLE数据库研究这10个基因在TNBC细胞系中的表达水平（B）。在紫杉醇处理组和空白组中沉默BYSL和MYC会抑制TNBC的形成和增强PTX敏感性（C-6E）。敲除FDPS,ENO1和PMVK会抑制TNBC的形成并增强PRX敏感性（C-6F）。

结论：

本研究作者使用公共的TNBC的单细胞转录组数据进行分析构建了新辅助治疗前后的单细胞转录组图谱并鉴定与TNBC的NAC耐药相关关键基因。此外，作者使用公共的TNBC的转录组数据进行分析鉴定到3-基因模型可以准确预测TNBC患者的RFS。本研究为今后的TNBC的靶向治疗提供有价值的信息。