各位小伙伴大家好！今天给大家分享一篇今年6月发表在Mol Oncol（IF=6.6）上的文章。作者建立了单细胞蛋白质组学分析流程，通过质谱流式技术与单细胞思路研究三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）的异质性和肿瘤微环境，从而发现具有预后潜力的分子。

研究背景

三阴性乳腺癌是高度异质性的，具有侵袭性和预后差的特点。由于TNBC缺乏雌激素（estrogen，ER）、孕激素（progesterone，PR）和人类表皮生长因子2受体的表达，细胞毒性化疗仍是早期和晚期TNBC的首选治疗方法。不过，靶向疗法和免疫疗法的多项临床试验也正在进行中。

结果

大规模单细胞蛋白质组描绘TNBC细胞景观

26例未经治疗的三阴性乳腺癌，包括24例3级高分化肿瘤和2例2级中分化肿瘤。肿瘤样本制成单细胞悬液，与内部对照癌细胞系和PBMCs一起贴上质谱标签（mass-tag barcoded），然后用一组表面抗体和细胞内抗体对样本进行连续染色（A）。

设计该抗体组的目的是为了鉴定已知有助于乳腺癌进展的肿瘤细胞亚群（癌细胞间充质干细胞标志物的CD24、CD44），与EMT/MET可塑性相关的表面分子（EpCAM、Vimentin）和反映乳腺癌细胞可塑性的新型表面抗原（CD29、CD97、CD49c、ITGB5）。作者还添加了亚型标志物：基质细胞（CD90、Vimentin和aSMA）和免疫细胞（CD45、CD3、CD14、CD19）。纳入了TGF-b/SMAD、NF-jB、JAK-STAT、PI3K/AKT/mTOR和Wnt信号通路的通路标志，从而在蛋白质水平上检测肿瘤相关信号通路的激活情况。

从26个样本中获得了894942个高质量的单细胞蛋白质组图谱。tSNE发现大多数细胞来自造血细胞（CD45+），其次是基质细胞（CD90+）和癌细胞（PanCK+；图 1C）。

图 1 通过质谱分析TNBC样本中肿瘤异质性的特征

Ki-67阳性率和淋巴结受累情况是患者预后的替代指标

作者利用RAPID识别表型不同的人群和确定能否对患者的生存率进行分层。由于没有转移和存活率等长期临床数据，所以作者测试和验证原发肿瘤的"Ki-67阳性率和淋巴结比值"（LNR）可以作为TNBC的替代预测和预后标志物。作者还在两个独立的TNBC芯片队列中验证了该方法的可行性。

与临床参数相关的癌细胞亚群

对癌细胞应用FlowSOM算法来识别所有markers在所有细胞上的总体表现并检测可能被忽略的子集。然后直接将FlowSOM簇与Ki-67+ LNR指数关联起来，发现了8个表型不同的PanCK+细胞群（A）。这些亚群的上皮-间质转化/间质-上皮（EMT/MET） marker（Vimentin），细胞黏附分子和整合素（CD29、CD49f、CD97、CD44、CD90），信号分子(pNF-jB、HLA-DR)的表达模式都不同，而且Ki-67+ LNR指数也不同，簇8的评分最高，簇4最低（B）。簇8中癌细胞还表现出CD97、pNFjB和HLA-DR高表达，CD90和Vimentin低表达；簇4则相反（C）。CD90和Vimentin的高表达通常与EMT有关，而且EMT及其MET是导致TNBC可塑性和异质性的原因。因此，作者决定预测患者队列中癌细胞的 EMT-MET表型。

根据选定的上皮和间质分子计算了每个细胞和所有患者的MET得分。Vimentin、aSMA和CD44作为间质标记，EpCAM、CD49f和CD9作为上皮表型的代表。得分范围从代表完全间质表型的-3分到代表完全上皮表型的+3，混合表型的得分在0分左右。26个样本中有23个样本的EpCAM高度阳性，50%以上癌细胞表达这种上皮标志物（D）。MET评分与Ki-67+ LNR指数呈负相关（E），表明癌细胞倾向于EMT/MET混合表型，这赋予了癌细胞高度的可塑性和更强的适应性，并且这也是肿瘤发生和发展所必需的。

图 2 TNBC肿瘤中癌细胞分析

TNBC基质组分的异质性

通过对CD90+/PanCK/CD45基质部分无监督分析，发现基质亚群显示出不同的表型，但是基质集群（A）显示出相似的Ki-67+ LNR指数，只是数值略有不同，最高的是簇4（0.84），最低的是簇9（0.72；B），表明基质亚群不能根据Ki-67+ LNR指数对患者进行分层。

与簇9相比，簇4中细胞高表达aSMA、CD90、CD29、CD49c和Ki-67，表明该亚群的增殖活性增强（C）。由于包括CD49c在内的粘附分子和整合素可能在肿瘤进展过程中发挥功能，作者检测了这些分子是否也存在于基质细胞中。发现CD49c-、CD49f-和CD97-细胞以不同的比例存在于各细胞簇中（D）。这三种表面分子与CD90和CD44共表达，并有少量“活化细胞群”表达pSmad2、活性b-catenin和磷酸化Akt（E），表明基质亚群共表达的信号分子可能会促进疾病的进展，不过，这还需要进行精确的功能实验加以验证。虽然基质部分在Ki-67+ LNR指数没有差异，但作者观察到了基质细胞的异质性，并发现了值得进一步研究的亚群。

图 3 TNBC基质组分鉴定。

常规、低维免疫组化验证复杂的TNBC表型

作者在包括200多份样本的TNBC回顾性队列中研究了我们的质谱蛋白与患者预后之间的关联。通过不需要先进的仪器且在临床病理部门广泛用于诊断目的的免疫组化来解决作者研究的新切除患者缺乏长期临床随访数据的局限性。

首先，作者组建了包括108个原发瘤的TNBC组织芯片，存在匹配的转移性淋巴结也保存。然后对这组样本进行受累淋巴结的临床注释，如果有生存率数据也保存。基于质谱分析的无偏结果，作者选择了在癌细胞和基质细胞中表达量显著差异的Ki-67+ LNR高和低簇的蛋白质（CD97、HLA-DR、pNF-jB和aSMA）。已知的EMT/MET标记EpCAM、CD49f和Vimentin也被纳入（A）。组织病理学分析表明，与配对的原发瘤相比，转移性淋巴结瘤中EpCAM、CD49f、Vimentin、CD97、HLADR和pNF-jB的表达模式有所不同，但不具有统计学意义（B），并且转移性淋巴结患者异质性大。使用组织学MET评分对该队列中EMT/MET状态进行分类，发现这种专门从肿瘤中提取并用质谱流式细胞术分析的hMET评分与实际的质谱流式细胞术MET评分一致（C）。

作者发现只有播散到淋巴结的肿瘤中EpCAM的表达显著增加，所以EpCAM水平可以将原发肿瘤切除时有淋巴结转移与没有淋巴结转移的患者区分开来。肿瘤部分中的HLA-DR和pNF-jB水平并未对患者生存进行分层。但是，与质谱流式细胞术数据一致，CD97的癌细胞表达增加与较差的总体生存显着相关（D）。

图 4 TNBC队列中通过质谱流式细胞仪鉴定的分子的免疫组织化学染色

小结

在最近单细胞和空间组技术研究TNBC异质性达到了意想不到的水平的背景下，作者又别出心裁地提出了单细胞蛋白组学流程。文章的构思精巧，创新满满：