5+分析思路：miRNA预后模型

        本文介绍一篇HNSCC预后分析：A robust six-miRNA prognostic signature for head and neck squamous cell carcinoma，2020年4月份发表在Journal of cellular physiology（IF=5.546）上，作者从TCGA下载HNSCC的miR-seq表达数据，在TCGA训练集中构建生存相关的miRNA 风险signature，在TCGA验证集和独立的验证集中检验预后效能。后续再通过体外实验验证关键miRNA的功能，接下来详细介绍科研思路。

        1.在训练集中计算差异表达miRNA

        作者将TCGA的521个HNSCC样本分为训练集和验证集，在261个训练集中计算癌症样本与正常样本的显著差异表达miRNAs，共计305个，如中火山图和热图所示。

        2.在训练集中构建预后signature

        基于差异表达的miRNAs，通过单变量Cox比例风险回归分析筛选出与患者生存相关的miRNAs，通过LASSO回归方法进一步选择9个miRNAs，多变量Cox回归分析显示有6个miRNAs具有独立预后因素：hsa-miR-99a-5p，hsa-miR-758-5p，hsa-miR-329-3p，hsa-miR-137-3p，hsa-miR-1229-3p，hsa-miR-3187-3p，c展示了这6个miRNAs的表达水平。在每个样本中基于以上6个miRNAs的表达值和计算出的回归系数的乘积和，即可得到风险得分（a-b），依据中值将261个样本的训练集分为高风险组、低风险组，d生存分析观察到高风险组具有较差的生存时间（p<0.001, HR=1.316），并且年龄、性别、分期的不同分组方式的趋势是一致的（e）。

        3. 在验证集中验证signature的效能

        将signature应用到验证集中观察预后效能，展示的是TCGA中另外的260个样本作为验证集的结果，d生存分析显示构建的signature仍然是具有统计学显著性的（p=0.029, HR=1.125）。在中作者采用独立的SMUSH验证集（p=0.021, HR=1.178），包含南方医科大学口腔医院的106个样本。整体上，该signature是独立的预后因素。

        4.构建nomogram模型预测患者生存

        作者通过nomogram方法构建了更为敏感的预测模型，将风险得分与年龄、性别、肿瘤分级分期等临床病例特征整合到nomogram模型中预测患者预后（d），该模型对于患者的三年生存率和五年生存率具有很好的预测效能（e-f）。

        5.富集分析

        在TargetScan、miRTarBase、miRDB数据库中搜索这6个miRNAs靶基因并进行基因功能富集，探索到底影响了哪些生物学功能，在GO、KEGG的富集分析结果中显示（），富集的top通路是Hippo、Wnt、mTOR、MAPK以及癌症相关的通路。

        6.实验验证

        作者选择miR-1229-3p在体外进行实验验证，下调miR-1229-3p、上调miR-1229-3p，结果发现miR-1229-3p的表达与HNSCC细胞的增殖、侵袭能力相关，表达上调时细胞增殖、侵袭能力增强，表达下调是细胞增殖、侵袭能力减弱。

        综上所述，本篇文章从公共数据集TCGA挖掘miRNA预后signature，分别用TCGA和作者自己的验证集进行验证，从干（富集分析）、湿（体外实验）两个角度研究miRNA的功能。作者肯定是位左右互搏的高手，你学会了吗？