Morning, guys! 今天我们来看一篇去年（是的，2020年已经成为过去式了!）12月份发表在Cell Reports(IF=8.109)杂志上的文章，作者通过分析单细胞RNA-seq数据，在分子层面对IgA肾病（IgAN）的发生发展做了进一步阐释。Single-Cell Transcriptomics Reveal Immune Mechanisms of the Onset and Progression of IgA Nephropathy利用单细胞转录组学揭示IgA肾病发生发展的免疫机制小编先带大家简单了解一下IgA肾病，这是一种典型的自身免疫性疾病，其特征为肾小球系膜区的IgA(免疫球蛋白A)沉积，临床表现为反复发作性肉眼血尿或镜下血尿，目前无特殊治疗方法，主要还是以保护肾功能，减慢病情进展为主。单细胞RNA测序方法大致可分为两类，一是基于液滴(droplet)的方法，这类测序方法可快速捕获数以千计的细胞以及多种细胞类型，但基因数的覆盖范围有限；另一类以SMART-seq2和STRT-seq为代表的方法虽然基因覆盖度较高，但细胞数有限。基于单细胞转录组测序数据的分析一般包括这几方面：根据基因表达特征划分细胞群寻找细胞群之间的差异表达基因差异表达基因的功能富集分析通过marker gene鉴定细胞类型拟时序分析细胞演变过程这篇文章利用改良的细胞分离策略和STRT-seq方法，从肾皮质活检中获得了主要的细胞类型，最终每个细胞生成了一个包含3,000多个基因、30,000个转录本的数据集。研究收集了13名IgAN患者的肾活检样本和6名患者肾切除标本的正常组织；此外，还采集了5名健康捐赠者和13名IgAN患者中5名患者的外周血。接下来就是提取细胞进行免疫荧光染色和单细胞测序(原始数据编号为GSA: HRA000342)，然后对测序数据进行预处理，最终保留了2,022个来自13名IgAN患者的细胞、763个来自6例健康肾组织的细胞、632个来自5名IgAN患者外周血的细胞以及203个来自5名健康捐赠者外周血的单核细胞，总计3620例单细胞样本。对这些样本，作者利用R包Seurat进行了降维和聚类分析，对未能分类的细胞作者又根据已有研究做了参考成分分析。然后，基于CellPhoneDB预测两种细胞类型间富集的受体-配体互作对，互作强度通过R包igraph进行可视化；用DAVID对系膜细胞做了GO功能富集；通过GSEA分析了肾脏驻留巨噬细胞富集的信号通路；基于Spearman相关性进行了分层聚类以分析IgAN收集导管上皮细胞的异质性，并进一步利用monocle包对插层细胞做了伪时序分析，揭示纤维化过程。最后，根据已发表的GWAS研究评估IgAN风险基因的细胞类型特异表达。下面，我们详细看一下文章的结果部分。结果一：肾皮质组织中的细胞分类研究分别对正常和IgAN组织中的细胞进行了分类，识别了9种不同的细胞类型(.B-C)，每个患者的细胞也都均匀分布在不同簇中。

图 1. 肾细胞分类接下来作者分析了每个细胞簇中已知肾细胞marker genes的表达模式（.D-E），每个簇中高表达的代表性基因如所示。

. 细胞特异性基因标记结果二：细胞特异性的基因表达模式IgAN的特点就是系膜区IgA的大量沉积，作者通过比较正常的和IgAN的系膜细胞，发现IgAN细胞中的JCHAIN显著上调，并通过免疫荧光染色进行了验证（.A-C），这一模式可能与IgA的识别与转运相关。然后，研究分别对正常和IgAN的系膜细胞做了GO功能富集，正常细胞主要富集在细胞粘附和上皮分化发育，而IgAN细胞则主要富集在ECM组织、细胞粘附、胶原纤维组织和炎症反应等（D），反映了IgAN系膜细胞异常激活的分泌功能。此外，基因THY1、FN1、WFDC2和SPP1等基因也在IgAN系膜细胞中高度表达（B）。这些结果表明，系膜细胞分泌的炎性细胞因子和趋化因子可能有助于建立系膜细胞与组织免疫细胞之间的关联，进一步放大炎症反应。

. IgAN中系膜细胞的基因表达模式结果三：细胞-细胞相互作用加速了IgAN的进展研究用CellPhoneDB预测了正常样本和IgAN样本中细胞类型特异性的相互作用，发现正常样本中大多数细胞互作发生在上皮细胞，而IgAN样本中最常见的细胞互作发生在系膜和内皮细胞中(.A-B)，正常和IgAN肾细胞中的互作也表现出了类似的模式，即同正常细胞相比，膜细胞与内皮细胞之间的互作显著增加，而IC和足细胞相互作用明显减少(.C-E)。研究进一步分析了系膜细胞上的配体和内皮细胞上的受体之间的互作对，发现ANGPT1/TEK互作占比最高，并通过对肾活检标本的免疫荧光染色，验证了系膜中ANGPT1的上调（F-H）。

. 特异性细胞互作网络免疫异常反映慢性疾病的进展巨噬细胞和T细胞是IgAN间质中主要的浸润细胞类型，接下来，作者对肾驻留巨噬细胞做了基因集富集分析，结果表明Notch信号通路和调节糖酵解、脂肪酸和氨基酸代谢的通路在IgAN中高度富集，而这些物质代谢有助于免疫细胞增殖和炎症细胞因子的产生(.A)。此外，作者还发现CCL2和CX3CR1在IgAN中高度表达(.B)，IgAN样品中的CD14+ 外周血巨噬细胞(PBMCs)表现出明显的干扰素应答。为了区分CD14+ PBMCs和肾驻留巨噬细胞，研究评估了正常和IgAN样本中CD14+单核细胞的基因表达相关性。从D-E可以看出，二者均表达了它们的特征基因，此外，T细胞也基于其marker genes的表达被识别出来，并且与正常CD8+ T细胞相比，IgAN CD8+ T细胞中FCGR3A、GZMB、KLRD等与细胞毒性相关基因的表达明显降低。

. 肾驻留巨噬细胞和T细胞的基因表达特征IgAN中间介细胞的转变伴随着纤维化同正常组织相比，IgAN中间介细胞(ICs)与其他肾细胞的互作显著减少，通过计算从正常和IgAN样本中收集的导管上皮基因表达相关性，发现了IgAN中ICs的异质细胞群(.A)。因此，作者使用PCs和ICs的细胞类型特异性标记基因对导管上皮细胞进行监督聚类，发现了两种同时表达PC和IC标记基因的细胞类型(.B)。然后，研究通过Monocle 2利用拟时间分析来揭示新细胞类型的演化过程。生成树显示了三种不同的细胞状态：IC、IC1和IC2(.C)，进一步分析表明，IC1和IC2同时表达IC和PC标记基因(.D)，这两种细胞也都富集了Wnt和成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路(与上皮-间质转化EMT相关的通路)的受体和靶基因。IC1和IC2的基因表达模式表现出对与EMT和纤维化相关的基因和转录因子的高度富集，尤其是已证实与IgAN相关的重要纤维化调节因子S100A4(.F)。

. IgAN中肾导管细胞转变及基因表达特征的鉴定总的来说，这篇文章的分析符合一般套路，并存在细胞数量少等不足，但通过分析配体-受体的表达来预测细胞-细胞互作，揭示了内皮细胞和肾驻留免疫细胞在IgAN发展中的重要作用，具有一定的指导意义。今天的分享就到这了，have a nice day!欢迎关注转录组| 甲基化 | 重测序 | 单细胞 | m6A|多组学  cytoscape | limma | WGCNA |水熊虫传奇|linux电泳 | PCR | 测序简史 | 核型 | NIPT | 基础实验 基因| 2019-nCoV | 富集分析 | 联合分析 |微环境 瘟疫追凶| 思路汇总| 学者 | 科研 | 撤稿| 读博|工作