哈啰大家好！~~本精神小伙儿又来更新啦！！

10X 系统免疫分析入门系列到今天是第四期了，必须是要完结的。战线拉得太长的话，时间间隔太大，不方便各位进行参考学习。以后在我的实际工作中，如果有什么新的体会，我会以简短番外的形式不定期更新该系列，请大家继续期待~~最后这一期我们来讲一讲cellranger vdj可视化结果的解读。我之前说过，10X系统好就好在它上手迅速，流程完备，封装完美，傻瓜式一体机操作，虽然是基础分析，但胜在结果可读性强，容易理解。上回书讲了结果文件中的一些表格类，序列类和注释类文件的解读。这回我们抛开那些冰冷无趣的数字，来康康五彩缤纷的图表类结果。在10X V(D)J cellranger流程的结果文件中，有一个文件以 .vloupe为后缀，这个就是可视化结果。在安装完Loupe V(D)J Browser之后（安装问题见第一期），我们就能在这个软件里打开可视化结果。这里面需要注意的是，单细胞转录组分析的可视化结果所用的软件叫Loupe Cell Browser，和用来看免疫结果的软件不一样，用的时候不要混淆。用Loupe软件打开 .vloupe文件，首先会看到一个柱形图。这个柱形图反应了该样本中，每一种不同的BCR（TCR）克隆型出现的频率（也就是在该样本中，有多少个不同的细胞中存在相同的克隆型），从大到小依次排序。在主面板的上方，偏右侧的两个按钮可以设置柱形图的展示数量，并实现频率与所占百分比的转换。最右面的按钮可以将柱形图下载到本地。最左面的下拉菜单可以选择柱形图的展示内容。除了可以看克隆型的分布之外，还能查看CDR3序列的丰度，以及VDJ基因的分布和丰度。页面的右侧展示每一个克隆型的具体信息，包括克隆型的链类型，即TCR是α链（用TRA表示）还是β链（用TRB表示），在BCR里，则表示是重链(IGH）还是轻链（IGK或IGL）。每个克隆型标注了检测到的VDJ基因（D基因常因较短，突变较多而捕捉不到）名称，最后一列是该克隆型的频率信息。右侧最下方，可以根据不同的条件，对想要的克隆型进行筛选。可以输入想要的CDR3区域的氨基酸序列或者核苷酸序列，或者查找特定的VDJ基因等。下载按钮序列可以对筛选出来的克隆型进行下载。当把鼠标移到右面，点击任意一个克隆型的任意一条链时，整个界面会从Chart View模式进入 Chain View模式。这个模式当中包含的要素过多，我挑重要的部分给大家说一说。（突然押韵）Loupe这个单词，本意是放大镜，有时特指珠宝商用来看珠宝的那个专用的镜子。所以，这个软件名副其实，能带我们看清结果中的很多细节。主面板最左侧，第一行是reference序列，就是在cellranger比对过程中加载的参考序列。下面一行是consensus序列，具体含义上一讲说过了，请大家自行回顾。接下来则是barcode序列，每一条barcode都代表一个细胞，也就是说，这个克隆型在这些个细胞当中表达。右侧展示的依次是VDJ基因。点击上方的放大图标，Chain View的分辨率会放大到单个碱基的精度。拖动下方的进度条可以完整查看整条序列的碱基排序。点击右上角的问号可查看图例。图例中用不同的颜色标识了每个细胞该克隆序列中碱基的插入、缺失和错配位点。深灰色则代表CDR3区域。绿色代表起始密码子，常见于V基因的开端。前面说的是单个样本结果的查看。点开上方的文件夹图标，就可以打开另一个样本的可视化结果，然后进入样本间的比较环节。比较模式可以在上方标题栏切换，然后选择想要比较的样本对象。和前面的分析一样，下拉菜单里可以选择想比较的项目。包括克隆型的数量，高频的克隆型之间的重叠程度。（这里说一下，计算overlap是通过比较CDR3序列来认定的，并不是通过ID对应，不同样本之间的clonotype_id不能直接对应，一定要切记）之前讲过，拿BCR来说，重链的免疫原性与重链的恒定区有关，重链分为IGG、IGA、IGH、IGM和IGD五大类，搭配的轻链有两种，在结果中被标注为IGK和IGL。Loupe软件可以显示不同样本之间，轻重链不同亚型搭配的比例。Loupe V(D)J Browser还有很多其他的功能，大家可以自己慢慢去摸索。如果暂时不具备条件去从头到尾梳理整个流程，从原始实验数据开始做的话，可以先去官网下载示例数据。示例数据中不仅包括可用于cellranger运行的Fastq序列，还提供cellranger的结果数据下载。这意味着研究者可以直接下载需要的表格结果或者可视化结果，先熟悉数据构成。好啦！！！本节到这里就讲完啦！整个系列完结撒花！！~~~现在我们来回顾一下：第一节我们讲了V(D)J测序的原理，还有BCR和TCR的构成等免疫学基础知识；第二节我们讲了cellranger vdj的使用方法；第三节我们讲了cellranger vdj基础结果的解读；最后这一节我们讲了cellranger vdj可视化结果的解读和Loupe软件的使用。希望大家能喜欢这个系列，也能继续支持本碎嘴子小编~~请在评论里留下你们对我的爱~~毕竟有的人嘴上说着不在意，心里还是非常期盼能得到大家的肯定的嘿嘿嘿~

我会努力工作，持续把工作中学到的方法技术和大家分享~下次见啦！古德拜！~