2021年6 月 11 日，一篇题为“Identification of a novel inflamed tumor microenvironment signature as a predictive biomarker of bacillus Calmette-Guerin immunotherapy in non-muscle invasive bladder cancer”的文章在CLINICAL CANCER RESEARCH上，文章详细解析了利用RNA counting methods确定非肌肉浸润性膀胱癌基因表达特征，评估预后和预测意义，为准确预测哪些肿瘤最有可能复发和进展提供了重要帮助。

研究背景

       当前非肌肉浸润性膀胱癌 (NMIBC) 的风险分层不充分，依赖于临床病理特征，准确预测哪些肿瘤最有可能复发和进展为肌肉浸润性疾病的能力有限。NMIBC 患者需要频繁接受侵入性膀胱镜检查的密切监测，使膀胱癌成为治疗费用最高的癌症。因此，迫切需要 NMIBC的预后和预测生物标志物。

       RNA counting methods（NanoString-nCounter）不需要酶促反应，允许将 FFPE 样本用于表达谱分析，但这些方法的可行性和价值尚未在 NMIBC 中得到有力评估。 因此，研究者试图通过 RNA 计数的方法确定NMIBC基因表达特征，以确定与临床病理特征的关联，评估预后和预测意义，并评估基因表达数据相对于 NMIBC 中已建立的 DNA 突变测序方法的附加价值。

研究路线

研究结果与结论

1、患者和肿瘤特征

实验结果：1）临床 NMIBC 标本来自两个地点，北卡罗来纳大学教堂山分校 (UNC) 和纪念斯隆凯特琳癌症中心 (MSK)。从 41 名 UNC 患者和 68 名 MSK 患者的肿瘤样品中提取 RNA，其中分别有 28个样品（68%）和 50个样品（74%）符合 QC 标准（具有低 (<30%) 肿瘤细胞数量的样品更经常无法通过 QC）。

2）复发结果仅适用于 MSK 队列，临床病理特征与该队列中的复发风险无关（表 1）。MSK 队列的中位随访时间为 39个月，23 名患者出现复发。接受 BCG 免疫治疗的 38 名患者（76%）的中位随访时间为 38.2个月，18 名患者出现复发。

实验结论：尽管存档的 FFPE NMIBC 临床样本由相对有限的肿瘤组织和低肿瘤细胞构成，但是可由于进行RNA 计数基因表达分析。

2、通过RNA counting methods进行分子分型

实验结果：1）研究者使用源自 NMIBC 样本的大型 UROMOL 队列的基因表达分类方法来确定分子亚型，NMIBC样本队列在先前描述的3个UROMOL 亚类中分布良好（）。

① UROMOL 亚类1类，被描述为管腔样/高分化，在低级别Ta肿瘤中富集，由于其主要为乳头状结构，肿瘤细胞更大。正如预期的那样，在UNC和MSK队列中，这些肿瘤的FGFR3基因表达水平显著升高（）。

② 与UROMOL 2类肿瘤是最具侵袭性的亚型相一致，在两个队列中，它们的增殖表达得分和FOXM1的表达最高（）。

③ UROMOL 3类，以前被描述为早期基底样亚型，在高级别T1肿瘤中富集。

实验结论：UROMOL 分子亚型与预期的临床病理特征相关。

2）在整个 MSK 队列或 38名接受 BCG 治疗的患者子集中，UROMOL 类别和 RFS 之间没有相关性（图 5A-B）。通过分析来自UROMOL研究的公开数据， 发现在UROMOL研究中2类与较差的RFS相关（n=438），但在接受卡介苗治疗的患者中，亚型与复发率无关（n=83）（C-D）。

实验结论：UROMOL 分子亚型与预期的临床病理特征相关，但与 BCG 反应无关。

3、免疫基因表达与特征

实验结果：1）由于在MSK或UROMOL队列中，UROMOL分类不能预测BCG治疗后的复发，研究者试图评估其他基于RNA的标记物作为BCG免疫治疗临床获益的潜在预测性生物标志物。

① 评估已知免疫相关基因的表达显示，NMIBC肿瘤在所有研究的免疫基因中可分为低表达或高表达，没有出现具有更复杂模式的组（A）。

② 在 MSK 队列以及治疗的亚组中，具有高免疫评分的肿瘤与使用 BCG RFS 的改善相关（B-C）。

③ 研究者进一步使用 UROMOL 队列从外部验证免疫评分，发现较高的免疫评分与 BCG 治疗的 83 名 UROMOL 亚组患者的 RFS 改善相关（D-E）。

实验结论：免疫评分可以提供一种合理的、生物标志物驱动的方法来选择哪些患者最能从诱导和维持 BCG 中受益。

2）研究者试图确定哪些353个个体免疫相关基因与卡介苗治疗后的良好结果相关。

① BCG治疗后2年以上无严重复发的相关因素包括HLA Ⅰ类组织相容性抗原、颗粒酶B（GZMB）和诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）的高表达。令人惊讶的是，研究者发现免疫检查点基因PD-L1和LAG-3的高表达也与BCG治疗后保持无复发相关（A）。

② 在研究者的样本队列中，预处理NMIBC标本中PD-L1、PD-1和CTLA-4高表达与BCG免疫治疗后较低的复发率相关，表明这些分子对应于免疫浸润的增加，与BCG耐药性无关（B）。

③ 在83名接受卡介苗治疗的UROMOL 亚组患者中检查这些免疫检查点基因的预处理表达水平，发现卡介苗治疗的患者中与RFS没有关联（C）。

④ 来自西北HGT1队列的治疗前标本中PD-L1、PD-1和CTLA-4的表达也与卡介苗治疗后的RFS无关（）。

实验结论：PD-1/PD-L1 表达可能不促使患者对 BCG 免疫疗法抵抗，并且 PD-L1、PD-1或CTLA-4高表达的患者不应排除 BCG 治疗。

4、基于基因表达的特征与体细胞 DNA 突变之间的关联

实验结果：1）在MSK 队列中， FGFR3 突变在Luminal 1 类肿瘤中富集，而在基底样 3 类肿瘤中很少改变。 ERBB2的改变在 1 类肿瘤中不存在，但在 20% 的 2 类肿瘤和 36% 的 3 类肿瘤中可见。染色质重塑基因 TET2 中的突变在基底样 3 类肿瘤中富集。 TERT 启动子中的体细胞突变在 UROMOL 2 类肿瘤中高度富集，发现存在于所有 20个样本中（100%）（表2）。

实验结论：鉴于 NMIBC 患者中这些基因组改变的普遍性，FGFR3 和 ERBB2 都是有吸引力的“靶标”。

2）TP53 和细胞周期基因的改变是 MIBC 和高风险 NMIBC 中最常见的遗传事件之一，研究者在 NMIBC 队列中探索突变 p53 通路的基因特征。

① 突变 p53 通路基因特征在 2 类肿瘤中最高，其次是 3 类肿瘤；这两个亚类具有最多的 TP53 突变（）。

② 基于 RNA 的 p53 通路评估检测到 p53 通路中的缺陷多于单独的 TP53 DNA 突变，并且与一组扩展的常见改变的细胞周期通路基因（TP53、MDM2、RB1、CDKN2A、CDKN1A、CCND1）的 DNA 改变具有相关性（图 10)。

③ 突变 p53 通路基因特征肿瘤具有高免疫评分，而 p53 野生型样肿瘤具有中等免疫评分（图 10）。

④ 高突变 p53 通路基因特征与增殖和 FOXM1 的表达增加相关（图 11）。

实验结论：基于 RNA 的 p53 通路评估与细胞周期通路基因的基因组改变之间存在重叠。

本文小结

       采用RNA定量平台NanoString-nCounter对两个独立队列（n=28，n=50）NMIBC样本中的基因表达进行分析。具有FGFR3突变和过度表达的低级别Ta肿瘤（UROMOL 1类）和具有更具侵袭性临床病理特征的肿瘤（UROMOL 2类和3类）的分子亚型之间存在差异，后者明显富集TERT启动子突变。

       在两个独立的队列中，UROMOL亚类与卡介苗（BCG）免疫治疗后复发无关。相反，炎症肿瘤微环境（TME）的新表达特征与卡介苗治疗后无复发生存率的提高有关。免疫检查点基因（PD-L1/PD-1/CTLA-4）的表达与炎症TME相关，但与 BCG治疗后较高的复发率无关。FGFR3突变和过度表达都与低免疫信号有关。这些研究表明，评估免疫TME而不是分子亚型，是一个有前途的预测BCG应答的生物标志物。

全文链接：https://clincancerres.aacrjournals.org/content/early/2021/06/11/1078-0432.CCR-21-0205