小伙伴们大家早上好，今天分享的文章是近期发表在《Cell Death & Disease》（IF：9.69）杂志上，本篇文章主要通过综合多组学分析，研究恶性细胞和TME在晚期肾细胞癌(RCC)发病中的作用，逻辑清晰，让我们一起来学习吧！！

Single-cell RNA-seq integrated with multi-omics reveals SERPINE2 as a target for metastasis in advanced renal cell carcinoma

一、摘要

晚期肾细胞癌(RCC)的肿瘤生长、转移和治疗反应被认为是由肿瘤及其微环境(TME)调控的。然而，RCC进展中的基因组、转录组和表观遗传变化的机制尚未完全明确。在本研究中，scRNA-seq数据来自8例RCC患者的组织样本，包括2对匹配的原发和转移部位(淋巴结)，以及Hi-C，RCC (Caki-1)和人肾小管上皮细胞系之间的高通量转座易接近染色质(ATAC-seq)和RNA-seq测序(RNA-seq)。在临床组织样本(407例RCC患者的芯片，TMA-30和TMA-2020)中验证了识别的靶点，并通过体外和体内实验通过敲除或过表达进一步验证了其功能。分析了30514个恶性细胞和14762个非恶性细胞的转录组。综合多组学分析表明，恶性细胞和TME在RCC发病中起关键作用。

二、结果

1.RCC原发和转移部位scRNA-seq图谱

对6名原发RCC肿瘤和2名两名患者的淋巴结进行单细胞测序（A-B），经过质量控制得到46552个细胞。根据染色体区域间的平均表达量计算每个细胞的整个染色体拷贝数变异(CNVs)，CNV结果展示了恶性细胞的异常分布，区分了30514个恶性细胞和14762个非恶性细胞（C）。CNV基因用BP网络展示（D）。原发性和转移性的恶性细胞CNV评分显著高于非恶性细胞 (E)。上皮细胞的评分基于EPCAM、细胞角蛋白和SFN等上皮细胞特征基因表达来表征，恶性细胞的上皮评分显著高于非恶性细胞(F)。

2.RCC TME的特征

14762个非恶性细胞被重新划分为T细胞、内皮细胞、巨噬细胞、B/浆细胞、NK细胞和成纤维细胞（A）。进一步对T细胞和成纤维细胞进行聚类，T细胞群被分为CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和调节性T细胞(Treg)，成纤维细胞重新聚集成两个亚组(B-C)。而30514个恶性细胞划分成6个细胞簇，E展示了标记基因的表达情况。

3. 恶性细胞表达模式的异质性和转移的识别

为了研究肿瘤中恶性细胞的表达模式，，作者通过NNMF算法分析恶性肿瘤共表达一致基因集，鉴定出四个和恶性细胞簇4不同的基因集（A）。对6个恶性细胞簇使用同样的方法识别出60个特征基因，然后，作者应用层次聚类对这60个特征基因进行整合，这些基因代表着不同恶性肿瘤亚群中不同共表达模式（B）。两个过程(cluster 1和cluster 2)主要由细胞角蛋白(cytokeratin)和EPCAM等上皮基因组成。虽然上皮标志物在所有的恶性细胞中都有表达，但很多上皮标志物在恶性细胞中普遍具有一致性，并能反映上皮分化程度和干细胞性。另一个过程反映细胞周期的G1/S和G2/M期，并在每个恶性亚群中区分不同周期的细胞 (B)。

4. SERPINE2在转移过程中起关键作用

作者查看了所有RCC样本中涉及转移的基因表达情况，这些基因在原发和转移性样本中都有表达，并且在至少两个样本中高表达（C）。对单细胞数据中恶性细胞和非恶性细胞进行差异表达分析，得到37个差异基因，并且在NNMF分析中同样被识别到（D）。在TCGA数据中计算常见基因和生存之间的关系筛选癌基因，滤过后发现高表达SERPINE2与较差的总生存期(OS)相关(E)。所有的恶性细胞亚群都表达SERPINE2，其中恶性细胞簇 1-3表达更高(F)。此外，原发恶性细胞表达最高的SERPINE2(G)。GSEA和GSAV结果显示，SERPINE2含量高的恶性细胞在细胞增殖、细胞移动和迁移途径明显富集。

比较SERPINE2在RCC细胞系和正常肾上皮细胞HK-2中的表达，发现Caki-1与其他RCC细胞株相比，SERPINE2表达量最高，Caki-1起源于人RCC转移瘤部位，进行Hi-C, ATAC-seq，并结合Caki-1和HK-2之间的RNA-seq，探索染色质空间结构和表观遗传因子是否参与了SERPINE2的基因和功能调控。SERPINE2位点间室状态为B(正常细胞)到A (RCC细胞)，该位点在ATAC-seq处呈开放状态，表明SERPINE2位点呈现主动相互作用 。RNA-seq结果还显示，与HK-2相比，Caki-1中SERPINE2的表达量较高。此外，SERPINE2区域表现出HK-2与Caki-1之间的TAD差异，表明Caki-1细胞中TAD大小随着新的TAD边界的产生而减小(I)。基于全基因组学和scRNA-seq, SERPINE2可能在RCC转移中发挥潜在的作用。

5. SERPINE2在肾细胞癌和药物反应中作为转移相关的癌基因

SERPINE2是纤溶酶原、尿激酶和凝血酶的抑制剂，研究表明它与肿瘤发生和肿瘤细胞侵袭相关，并在肺、结肠和胰腺癌中也普遍上调。为了研究它促肿瘤转移的机制，作者根据SERPINE2的平均表达评估TCGA患者的体细胞改变（高组;低组），MTOR、MUC16、NOTCH2和LPR1在SERPINE2高、低组中存在差异(A)。GSEA发现SERPINE2高组在EMT通路显著富集(B)。与未转移的原发肿瘤相比，SERPINE2在淋巴结或其他转移患者组织中高表达(C)。在GSE105261中，转移患者SERPINE2的表达也显著高于正常组织 (D)。

在GSE53757队列中，肿瘤中SERPINE2的表达显著高于正常组织 (E)。通过数据库分析TCGA样本对药物的敏感度，SERPINE2高组对舒尼替尼的反应IC50更高，与SERPINE2低组相比对药物反应更差 (F)。免疫浸润分析发现高SERPINE2组比低组有更高的免疫浸润(G)。单细胞中SERPINE2高组MTOR表达更高。CD8+ T细胞的耗竭的标记基因表明耗竭CD8+ T会影响免疫浸润（I）。在nivolumab治疗的患者中，较高的SERPINE2表达与较差的生存相关 (J)。以上结果表明SERPINE2可能是RCC中的一个恶性基因，并参与药物反应。

6.SERPINE2在体外和体内促进ccRCC侵袭，伴有上皮-间质转化(EMT)

为了研究SERPINE2是否可以促进RCC肿瘤恶化和转移，构建SERPINE2过表达细胞(786-O)和SERPINE2敲低细胞(Caki-1)，通过qPCR和Western blot观察(G)。通过集落形成、CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测，发现shSERPINE2组RCC细胞迁移和侵袭能力显著降低(A-B)，且OE-SERPINE2组显著升高(C-D)。sh-SERPINE2组细胞存活率显著降低，OE-SERPINE2组显著升高(E-F)。将稳定荧光素酶标记的786-O-OE-SERPINE2或786-O-NC-SERPINE2细胞注射到裸鼠尾静脉，发现与对照组相比，786-O-OE-SERPINE2组小鼠肺转移更为严重 (G)。碳酸酐酶9 (CA9)和SERPINE2在786-O-OE-SERPINE2诱导的肺转移位点高表达。

7. SERPINE2与低生存率相关，并预测RCC转移

通过IHC验证了组织微阵列在两个队列中的表达(TMA30;TMA2020)。H-score定量分析显示，肿瘤组织组SERPINE2的表达高于癌旁组织组 (A-B)。根据临床指标对样本进行分类发现，在转移组织、Fuhrman等级、肿瘤分期中IHC得分更高（C-E）。根据TMA30的5年OS在SERPINE2中进行ROC分析的最佳截断值，将患者分为高表达组和低表达组。H-score的cut-off值为202.5,AUC为0.8342(F)。KM生存分析结果显示，SERPINE2高亚组患者OS和无进展生存(PFS)较差 (G-H)。然后，对临床指标和SERPINE2进行列线图分析(I)，发现SERPINE2表达是ccRCC患者OS的独立危险因素。

三、小结

本篇文章通过多种分析方法研究RCC中恶性细胞和TME对转移、肿瘤发生发展的作用，作者研究了6个恶性细胞簇的表达一致的基因集来研究恶性细胞的机制。对于发现SERPINE2基因，通过在不同队列、临床指标的情况下进行比较，并通过药物数据库研究SERPINE2对药物反映的情况。基因敲除、IHC等分析方法证明SERPINE2是ccRCC患者OS的独立危险因素，并与较差的生存相关。本文逻辑清晰，在筛选恶性细胞簇的一致性基因时方法独特，值得我们学习！！