各位小伙伴大家好哇！今天小编给大家带来的是今年2月份刚刚发表在EBioMedicine (IF=11.205)上的一篇开发肿瘤预后signature的研究。最高端的研究往往采用最朴素的分析方式在这篇文章上提现的淋漓尽致，快来和小编一起看看吧！

一.研究背景

肿瘤是由嵌入在细胞外基质、驻留间充质细胞、内皮细胞和浸润免疫细胞的微环境中的恶性细胞组成。肿瘤微环境的这些宿主元素支持或抑制肿瘤进展，并影响对抗癌治疗的反应。

随着免疫检查点抑制剂(ICI)的引入，免疫微环境已经成为癌症研究的重点，它彻底改变了几种癌症的治疗方法。目前ICI的反应预测生物标志物主要包括肿瘤细胞的特征，如PD-L1表达、错配修复缺陷和肿瘤突变负担(TMB)。然而，这些生物标志物的预测准确性较为一般。因此，迫切需要建立新的可靠的免疫生物标志物来预测免疫治疗的预后和治疗反应。本研究中，作者对结肠癌的免疫图景进行了全面的概述，并解剖了肿瘤免疫微环境，特别关注促肿瘤免疫细胞亚类和那些对ICI抗性有潜在影响的细胞。确定了在结肠癌中具有最高预后价值的免疫细胞标志物，证明了该标志物在其他四种肿瘤类型中的预后能力以及其预测免疫治疗反应的能力。

二.主要结果

1. 结肠癌中CD8+ T细胞和CD68+/CD163+巨噬细胞预后特征的鉴定

为了绘制免疫细胞图谱，作者使用两个抗体板对肿瘤组织中的适应性免疫细胞和先天免疫细胞进行了多重免疫荧光标记。这些标记的共表达模式允许免疫细胞被分类为不同的亚群(a)。首先，作者将细胞密度评估为每个亚型在整个分析组织面积中的细胞数量，并使用三分位数作为截断值对病例进行分类，从而将每种免疫细胞亚型的病例分为低、中、高密度；然后，作者评估了I-III期结肠癌中不同免疫细胞密度的预后影响，结果表明CD8+ T淋巴细胞和CD68+CD163+巨噬细胞(b、c)与OS相关。

接下来作者假设CD8+ T淋巴细胞和CD68+CD163+巨噬细胞的相对浸润水平捕获了免疫微环境中抗肿瘤和促肿瘤方面的相互作用，通过计算CD8+细胞密度与CD8+和CD68+CD163+细胞密度之和的比值生成了一种组合免疫生物标志物，并将其称为“免疫激活的特征”(SIA)(f)。

2. SIA是结直肠癌和至少其他四种肿瘤类型的独立预后生物标志物

这一部分作者为了确定SIA对OS和RFS的预后价值，以及最先进的免疫评分系统进行比较。通过量化肿瘤中心和浸润边缘的CD3+和CD8+细胞密度生成了免疫评分样指标(IS)。结果表明，IS和SIA均与ⅰ~ⅲ期结肠癌患者的OS和RFS密切相关(a、b)。AUC分析显示T分期是当前OS的最强预测因子，N分期是RFS的最强预测因子(c)。最后，在同一模型中整合临床参数、IS和SIA, OS和RFS的中位AUC均有提高(c)。SIA对OS预测的相对贡献高于T期和N期，当将IS纳入模型时，SIA和IS的相对贡献超过50%，免疫细胞标志物超过临床因素(d)。

接下来，作者评估了SIA评分是否也适用于其他癌症的预后。作者分析了多种癌症患者SIA值与OS的关系，结果表明：在黑色素瘤、肺腺癌、膀胱尿路上皮癌和胃食管腺癌中，高SIA与较长的OS相关，而在子宫内膜癌、卵巢癌和肺鳞状细胞癌中无相关(a) 当对同一肿瘤进行分析时，IS仅在肺癌(腺癌和鳞状细胞癌)中具有预后意义，在子宫内膜癌中仅有趋势并无统计学显著性(b)。

此外，根据tAUC(time-dependent AUC)分析，SIA在预测上述癌症的OS方面优于IS(c)。作者还发现肿瘤类型对免疫信号表现出不同的依赖性，据此确定了四种不同的癌症类型(d)：(a) SIA依赖/ IS未知的肿瘤(黑色素瘤、胃食管腺癌、膀胱尿路上皮癌); (b) SIA和IS依赖性肿瘤(结肠癌、肺腺癌、子宫内膜癌); (c) SIA未知/ IS依赖的肿瘤(肺鳞状细胞癌);(d) SIA和IS无关性肿瘤(卵巢癌)。总结：肿瘤表现出不同于SIA和IS的依赖性，SIA在至少5种肿瘤类型中具有预后意义。

3. 影响预后的CD68+CD163+巨噬细胞产生补体复合物亚基C1Q

为了进一步定义CD68+CD163+细胞，作者分析了结肠癌、肺癌和葡萄膜黑色素瘤的单细胞RNA测序数据。作者根据CD68和CD163的基因表达水平(即CD68+CD163+、CD68+CD163−和CD68−CD163+细胞)确定了三个巨噬细胞亚群，对这三个巨噬细胞亚群的差异表达基因的分析表明，CD68+CD163+亚群的细胞过表达C1QA、C1QB和C1QC，它们共同编码C1补体复合体的一个亚成分C1q(a-c)。通过分析三个单细胞数据集，作者观察到C1QA、C1QB和C1QC几乎只在巨噬细胞中表达；在分析巨噬细胞亚类时，C1QA-C表达在CD68+CD163+巨噬细胞中是特异性的，在CD68+CD163−细胞中表达非常低(图 4d)。

作者认为，由于C1QA-C在癌症中的表达主要在CD68+CD163+巨噬细胞中检测到，因此在bulk RNA水平分析的补体C1q成分的合成可以用于估计肿瘤CD68+CD163+样巨噬细胞的数量。接下来作者通过计算CD8A表达水平与C1QA、C1QB或C1QC的比值对患者样本进行二分，并对多种癌症进行生存分析。结果表明除肺鳞状细胞癌和卵巢癌外，高比值的患者生存率较好(e)，总的来说，CD8与C1Q基因表达的比值与多种肿瘤类型的预后有关。

4. SIA预测免疫治疗的反应

在这一部分，作者对SIA是否可以预测ICI治疗的应答进行研究。作者分析了接受抗pd -1治疗的黑色素瘤患者的bulk RNA-seq数据，计算CD8A与C1QA、C1QB或C1QC基因表达的比值。结果显示，完全响应组的SIA值高于部分响应组和无响应组(a)。

为了更准确地评估signature，作者接下来分析了接受抗PD-1和/或抗CTLA-4治疗的黑色素瘤患者的单细胞测序数据。结果表明通过CD8A与CD68+CD163+、CD68+C1QA+、CD68+C1QB+或CD68+C1QC+计算的SIA值中，高SIA评分均和免疫检查点抑制剂疗效显著相关(图 5b)。

接下来，作者还分析了4例接受了ICI治疗肾细胞癌患者的单细胞RNA测序数据。考虑到CD68+CD163+巨噬细胞的补体共表达，与一名肿瘤进展患者相比，两名部分缓解患者的SIA较高(C)。综上，这些结果表明，SIA可以预测黑色素瘤和潜在的其他肿瘤类型对ICI治疗的反应。

至此，这篇文章就介绍完啦，是不是感觉简洁但又不失深度。总结一下：作者从实验出发，通过免疫组化标记所计算的免疫细胞密度，发现CD8+ T淋巴细胞和CD68+CD163+巨噬细胞与结肠癌患者OS相关，并且计算CD8+细胞密度与CD8+和CD68+CD163+细胞密度之和的比值为SIA值；第二步在多个癌症中探讨SIA值的预后效能；第三步通过单细胞数据发现C1Q基因可以在bulk数据中评估肿瘤CD68+CD163+样巨噬细胞的数量，于是简化SIA值为CD8A的表达与C1QA表达的比值；最后通过分析免疫治疗的单细胞数据验证了SIA具有可以预测ICI治疗反应的潜力。以往我们看到的文章大部分都是生信提出signature实验进行验证，这篇文章最大的亮点莫过于从实验出发定义signature，通过生信分析验证，让审稿人眼前一亮。全篇的生信分析也无非生存分析以及单细胞的基础分析，这个思路快快学起来！