Identification of Viruses and Viroids by Next-Generation Sequencing and Homology-Dependent and Homology-Independent Algorithms

本文总结了下一代测序技术在植物中识别病毒或者类病毒的发展以及homology-dependent和homology-independent的病毒识别的方法。

1. HOMOLOGY-DEPENDENT PATHOGEN IDENTIFICATION BY NEXT-GENERATION SEQUENCING TECHNOLOGIES

病毒宏基因组定义为来自于环境、植物和动物的所有的病毒基因组的总和，是一种非培养的一种研究。受早期动物病毒研究的成功的影响，从2009已发表不少于66关于关于植物病毒和类病毒的宏基因组的研究。病毒宏基因组包括以下步骤：样本的准备，DNA测序，生物信息学分析。

2. 样本准备:富集病毒序列的一些策略

Total RNA, Poly-A,rRNA depletion,dsRNA,virus-like particles,Small RNAs

Small RNAs

植物和无脊椎动物受到RNA病毒或者DNA病毒感染时产生virus-derived siRNAs。在植物中siRNAs可通过dsRNA复制中间体和微卫星RNAs得到。

越来越多的研究者选择运用small RNAs来识别植物病毒而不是其他策略比如dsRNA，rRNA的原因有一下几个方面。首先，植物中RNA病毒和DNA病毒的复制和亚病毒因子（类病毒和微卫星病毒）均会导致病毒特异的siRNAs的丰度的增加，siRNAs的丰度占total small RNAs大约30%。由于测序量和数据的复杂性均减低，在单个lane对多个样本进行测序仍能满足病毒发现所需的测序深度。其次，与dsRNA和VLP相比，small RNAs的所有replicating viruses and viroids原则上是均能够被测序检测到。这个优势对于疾病的诊断和隔离应用方面具有极大吸引力。再者，病毒和类病毒siRNAs是宿主感染时免疫激活的产物，并且由于siRNAs是通过特异的Dicer蛋白合成所以siRNAs的size distribution是不同于宿主的。Small RNAs的size distribution pattern或许可以揭示病毒在所感染的宿主中是否actively replicate。最后，small RNAs能够发现新的pathogens，于现有的分析工具发现的病毒不存在序列相似性。

3. Bioinformatics Analysis(生物信息学分析)

数据分析的步骤和使用的方法和软件以及一些注意事项。

新的病毒和发现和已知序列病毒的识别的判别条件。当contigs与已知病毒的序列相似性大于90%时则认为是known vituses。当contigs与已知病毒distant homology时，特别是在蛋白质水平上，这个contig则被认为是new virus that can be taxonomically assigned only at the level of the virus family。

宏基因组存在的瓶颈是如何对重新组装的contigs进行从头注释。有如下两种策略：Homology-Dependent Discovery of Viruses and Viroids in Plants和HOMOLOGY-INDEPENDENT IDENTIFICATION OF VIROIDS

利用二代测序新发现的病毒列表

    4. Conclusion

NGS用于病原体的发现存在许多挑战。首先，需要开发新的计算方法从海量的NGS数据中通过homology-independent方式去发现新病毒。这些新开发算法能够帮助识别出与现有数据库（比如GenBank）不存在同源性的序列的来源。其次，开发拥有友好用户体验的软件可以被广泛使用并且不需要进行专业的技能培训。最后，Koch’s postulates（柯霍氏法则）对于通过宏基因组方法发现的许多病毒和类病毒是不能够完全满足的。但是，因为宿主在被病毒感染时诱导产生病毒或者类病毒特异的siTRNAs，所以可以通

过small RNA sequencing技术作为机体免疫应答反应的一个佐证。

5. Summary Points

1) The power of next-generation sequencing (NGS) technologies to allow rapid determination of the total nucleic acid content in a biological sample has transformed the diagnosis and identification of viruses and viroids.

2) All viruses and viroids identical or similar to those described previously can be identified in a plant sample by a single NGS run and homology-dependent algorithms.

3) A total of 49 new viruses and one new viroid have been identified by NGS and homologydependent algorithms since 2009. Twelve of these viruses may become the founding members of new virus genera or families.

4) Common strategies to enrich viruses and/or viroids for deep sequencing include the purification of dsRNAs, virus-like particles, or small RNAs. However, identification of RNAandDNAvirusesaswellasviroidsinasingleNGSrunispossibleonlybysequencing total small RNAs.

5) The recent development of the homology-independent algorithm PFOR/PFOR2 makes it possible to discover novel viroids by deep sequencing of small RNAs and total RNAs either deleted of rRNA or enriched for circular RNAs. It is likely that PFOR will facilitate discovery of previously uncharacterized viroids in diverse plant and animal species in both agriculture and the environment.

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