SXR202307004C +10+单细胞绝妙联合，细胞学+免疫微环境双重机制

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已被用于在单细胞水平上直接分析基因表达和细胞内群体异质性，并且在细胞学和免疫微环境领域的研究已经取得了许多重要的突破，接下来介绍的这项研究，作者从细胞学和免疫微环境两个方面，利用scRNA-seq技术对肿瘤旁组织和胃腺癌（GA）组织进行了细致的分析，并为其准确诊断和治疗提供重要的研究资源。

今天分享的文章，于2023年在Nature Communications IF 16.6 Q1上发表题为“Single-cell analysis of gastric signet ring cell carcinoma reveals cytological and immune microenvironment features胃印戒细胞癌单细胞分析揭示细胞学和免疫微环境特征”的文章。

背景

胃印戒细胞癌（GSRC）是胃癌（GC）的一种特殊亚型，与不良预后相关。本研究使用单细胞RNA测序对GC样本进行了评估，并成功鉴定出印戒细胞癌（SRCC）细胞。SRCC细胞上调了差异表达基因，涉及异常激活的癌症和免疫应答信号通路，以及丝裂原活化的蛋白激酶和雌激素信号通路。SRCC细胞具有较低的细胞粘附和较高的免疫逃避能力，以及免疫抑制的微环境，这与GSRC的不良预后密切相关。综上所述，GSRC具有独特的细胞学特征和免疫微环境，可能有助于精准诊断和治疗。

介绍

GC是全球范围内常见的癌症类型，其发病率在全球排名第五，死亡率排名第四，在中国，晚期GC患者的诊断比例相对较高。但是对于GC的生物学机制的认识仍然处于初级阶段，导致晚期GC患者的5年生存率仍然低于5%。因此，进一步深入了解GC的分子机制和病理生理学对于改善GC的诊断和治疗策略具有重要意义。GSRC的组织学诊断主要依据超过50%的癌细胞为印戒细胞，表现出低分化、高恶性程度、强侵袭性、高转移风险以及对放化疗反应较差等特点，而SRCC是将细胞质中的大量粘液将细胞核挤压到一侧，使癌细胞看起来像印戒，因此得名印戒细胞癌，作者使用单细胞RNA测序scRNA-seq在单细胞水平上直接分析基因表达和细胞内群体异质性，定义细胞类型和细胞状态的动态转化，并识别新的细胞亚型。并应用于肿瘤微环境分析，包括肿瘤发生和免疫耐受背景，研究团队利用scRNA-seq技术对GA组织和癌旁组织进行了分析。我们重点比较了中度/低分化腺癌（M / PDA）和GSRC细胞学和免疫微环境方面的差异，为GSRC的准确诊断和治疗提供资源。

结果

利用单细胞测序鉴定癌旁和GA组织中的主要细胞类型

研究团队选择了接受根治性胃切除手术的13例胃腺癌患者进行单细胞RNA测序。经过过滤低质量的细胞、去除重复读数和纠正批次效应等处理，共获得了149,782个单细胞的转录组数据（a）。研究还从5名患者的癌旁组织中获取了32,456个单细胞，以及从13名患者的癌组织中获取了117,326个单细胞，用于验证训练队列中的差异（b）。通过主成分分析PCA和聚类分析，将细胞分为26个簇，并筛选出在不同细胞中上调表达的基因（c，d）。进一步通过对细胞类型的识别，确定了8个不同的细胞簇（e）。

恶性和非恶性上皮细胞的鉴定

通过对上皮细胞进行聚类分析，研究得到了20个子簇（a）。根据标记癌基因的表达水平，这些子簇被划分为5种细胞类型（b）。在验证队列中对上皮细胞进行聚类，进一步区分了不同的细胞类型（c）。同时，验证了这5种细胞类型标记基因的表达水平（d）。研究还在癌症组织中分析了上皮细胞的占比情况（e）。结果显示，粘液细胞的比例显著增加，进一步的免疫荧光分析发现这些粘液细胞标志物也在SRCC细胞中表达（f）。这些结果揭示了上皮细胞中不同细胞类型的特征，并提供了SRCC细胞中粘液细胞的重要标记基因信息。

使用验证队列鉴定恶性细胞和非恶性细胞的准确性

研究团队对M/PDA细胞之间的癌症相关得分进行了验证比较，发现两组之间的差异非常显著。同样，在对SRCC细胞和黏液细胞进行验证时，也得到了相似的结果（a，b）。

在单细胞RNA测序数据中，还对肿瘤细胞的拷贝数变异进行了分析，成功预测了恶性细胞和非恶性细胞中的拷贝数改变（c）。此外，还计算了CNV得分，并发现不同细胞类型之间的差异值显著t检验，p<0.001（d-e）。

在SRCC和粘液细胞中，主要富集了一些癌症相关信号通路，包括TNF-α信号通路、NF-κB信号通路和TGF-β信号通路等（f）。

总体来说，作者重新鉴定了上皮细胞的亚簇，并进行了相应的验证。

M / PDA和SRCC细胞之间的异同

通过对M/PDA和GSRC进行生物学行为的比较，发现它们在生物学特性上存在显著差异（a）。根据差异表达基因（DEG）的分析，发现GSRC中上调的基因主要富集在异常活跃的癌症相关信号通路和免疫逃逸信号通路，而M/PDA细胞具有较高的增殖和免疫监视能力，而GSRC细胞则具有较低的细胞粘附和较高的免疫逃逸能力（b-c）。

这些结果揭示了M/PDA和GSRC在生物学特性上的显著不同，尤其在肿瘤发展和免疫应答方面。

M/PDA和GSRC中B细胞的浸润特性为了比较肿瘤微环境的差异，对B细胞进行聚类，并查看4种细胞类型中的细胞标记基因表达水平（a）。通过t-SNE图的有效区分，我们发现了4种潜在的细胞亚群，为后续的数据分析和生物学解释提供了重要线索（b）。我们提取了B细胞的前10个基因形成热图。结果显示，MALT-B细胞主要表达IgA相关基因，而浆细胞主要表达IgG相关基因（c）。通过样本分析，我们发现在胃癌旁组织中，滤泡B细胞和记忆B细胞是M/PDA和SRCC的主要浸润细胞类型，而在GA和GSRC中，滤泡B细胞是主要的浸润细胞。总的来说，B细胞亚簇在GSRC中表现出与M/PDA不同的浸润特征，尤其是滤泡B细胞在GSRC中扮演重要角色。

M/PDA和GSRC中T细胞的浸润特性

研究查看了肿瘤微环境在T细胞方面的差异，使用T细胞重新聚簇，将子簇细分为10个细胞子簇，并定义了4种细胞类型中细胞类型（6a，b，c）

通过样本分析发现，CD4-Th17细胞、CD4-Tn或Tcm细胞和CD8-Teff细胞主要浸润在癌旁组织，说明这些细胞免疫功能较强（6d）。与M/PDA相比，GSRC中肿瘤浸润CD8-Teff细胞的比例较低，CD4-Treg细胞的比例较高，差异无统计学意义（6e）。研究进一步的IHC验证显示，与M/PDA相比，而GSRC中肿瘤浸润CD8-Teff细胞的IHC评分较低，Wilcoxon秩和检验，p = 0.0021，GSRC中肿瘤浸润CD4-Treg细胞的IHC评分较高，Wilcoxon秩和检验，p = 0.0032，差异都具有统计学意义（6f，g）。

GSRC中的T细胞亚群显示出独特的浸润特征，表现为CD4-Treg细胞增加和CD8-Teff细胞减少，形成免疫抑制微环境。

结论

研究发现SRCC细胞在细胞粘附和免疫逃避能力方面表现较低，存在免疫抑制的微环境，这可能与GSRC的较差预后密切相关。总体而言，与M/PDA细胞相比，GSRC细胞具有独特的细胞学特征和免疫微环境，这些结果对于GSRC的准确诊断和治疗可能具有重要意义。

【参考文献】

Zhao W, Jia Y, Sun G, Yang H, Liu L, Qu X, Ding J, Yu H, Xu B, Zhao S, Xing L, Chai J. Single-cell analysis of gastric signet ring cell carcinoma reveals cytological and immune microenvironment features. Nat Commun. 2023 May 24;14(1):2985. doi: 10.1038/s41467-023-38426-4.