摘要：随着测序技术的普及，数以百万计的错义突变被发现。然而，目前只有一小部分的错义突变的分子-表型关系被确定。因此，需结合实验和计算的方法来研究这些变异的效应。在实验角度，采用深度突变扫描（deep mutational scanning）和其他高通量方式是研究大量变异效应的有效方法。进一步，突变导致的蛋白质稳定性（protein stability）的改变是导致遗传性疾病的普遍原因，因此采用计算方法来预测蛋白质稳定性的改变也有助于评估变异的效应。此外，细胞水平的蛋白质控方法（cellular protein quality control）可以提供蛋白质稳定性改变和细胞蛋白水平和降解的关联。总之，结合计算生物物理学、保守性分析和机器学习方法有助于理解变异的效应和机制，以及疾病的治疗。 1，蛋白质稳定性的丧失是导致疾病的根源蛋白质的稳定性是蛋白质的重要属性，突变往往会导致蛋白质稳定性的改变。蛋白质稳定性的丧失则往往会导致功能的丢失。从生物物理学或者生物化学的角度看，蛋白质稳定性即为从非折叠态到折叠态的能量变化；当然，这种能量变化不仅与蛋白质序列有关，也与细胞蛋白质的质控系统、蛋白互作、细胞运输和翻译后修饰相关。大量的研究表明突变导致的蛋白质稳定性变化与遗传学疾病关系密切。因此，包括全突变扫描和计算模拟等不同的方法被用于研究蛋白质稳定性的变化。2，细胞水平的蛋白质质控系统细胞水平的蛋白质质控系统（Cellular Protein Quality Control），是指对于结构不稳定或者错误折叠的蛋白质，细胞内存在一套质控系统，可以将这些有毒性的蛋白产物通过重新折叠或者降解的方式进行消除。在真核生物中，大多数蛋白质降解是由泛素-蛋白酶系统（UPS）或者自噬溶酶体进行，后者主要负责错误折叠或者非溶性蛋白质。对于致病变异，一个关键的问题是蛋白质稳定性下降到何种程度会导致PQC系统被激活？虽然蛋白质种类差异颇大，但是有研究表明3kcal/mol的能量差异足以导致PQC的作用。 ：细胞蛋白质控系统控制蛋白降解机制。在正常的蛋白质中，降解信号肽（橘色区域）会被包埋在蛋白质内部，而在局部或者全非折叠结构中，一个或多个的降解信号被暴露。

3，深度突变扫描深度突变扫描（Deep Mutational Scanning，DMS）可以在single multiplexed assay中同时对成百上千个变异位点的效应进行评估。首先，对靶标蛋白构建大量的变异位点库，然后在特定的筛选条件下观察不同变异位点库的变化频率，筛选条件包括细胞活性（与蛋白活性有关）、荧光信号（与蛋白活性或者稳定性有关）或者采用分相或者酵母来选择结合受体。最后，筛选前后每个变异位点的频率通过二代测序来统计，并最终转换为一个分值来度量变异对蛋白相关性质的效应。 ：Deep Mutational Scanning for Protein Stability and Variant Abundance 4，变异效应的计算预测除了实验以外，还可以是采用一些工具和算法对变异位点进行预测。此处主要介绍三个方法：1）蛋白稳定性预测工具，如FoldX和Rosetta等；2）保守性预测工具，建议采用多序列多位点同时评估，如软件Gremlin；3）基于DMS实验数据，采用机器学习算法训练的预测模型，如Envision等。作者在MSH2基因上测试三种算法，并与Clinvar记录信息、genomAD频率信息对应分析，结果表现良好。 参考文献：Stein A, Fowler D M, Hartmann-Petersen R, et al. Biophysical and mechanistic models for disease-causing protein variants[J]. Trends in biochemical sciences, 2019.

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