在二代测序（Next Generation Sequencing）依然盛行之下，三代测序也迅速发展壮大起来。相比于二代测序，三代测序最明显的优势是测序读长，大约在几十kb，甚至超过100kb。目前主流三代测序技术主要是美国太平洋生物（Pacific Bioscience）的单分子实时荧光测序（Single Molecule Real-Time）和英国牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore Technologies, ONT）的纳米孔测序（nanopore sequencing）。

许多生信分析（比如差异表达、基因融合、通路分析）的前提和起始都是序列比对，即将测序片段比对到参考基因序列上。由于三代测序高错误率（15%左右）的特点，以往的适用于二代测序比对工具（short-read aligner，比如HISAT2, STAR）已经不再适用。为三代测序专门开发的长序列比对工具（long-read aligner）近年来相继涌现出来（NGMLR, GraphMap, BWA-MEM, Minimap2）。就文献引用量来看，以上提到的工具中Minimap2是最流行的（文章自2018年发表在Bioinformatics上以来，目前已经有2000+的引用量）。它同时也是ONT官方使用的对比工具。

Minimap2安装和使用速览

使用GitHub源代码安装

通过Anaconda安装

使用

Indexing

首次index一个genome或transcriptome会需要些时间，但是一劳永逸，后面的样本可以重复使用此index。

Alignment

更多详细的参数需要大家根据自己的数据，参考manual自行添加，但是一个容易被忽视的参数是--split-prefix=tmp，尤其当genome多于4GB时（比如人类genome），否则生成的SAM文件是没有header的，这样后续分析就会出问题。明明是一个很重要的信息，不知道为啥在manuel里不提及，而是藏在FAQ页面：https://github.com/lh3/minimap2/blob/master/FAQ.md （不要问我为何会发现这个问题）。

存在问题

Minimap2的GitHub页面也提到了他们意识到的一些缺陷，但是一般的使用情况下，都不会成为问题。然而在我们项目中，其中一个缺陷却成为Minimap2对我们的一个致命缺点：Minimap2会错失一些比较短的exon。因为在prostate cancer中一个很重要的基因融合TMPRSS2-ERG，往往是由TMPRSS2的exon 1和ERG的一些下游exon融合而成，但是有一些TMPRSS2的exon 1非常短（~80 bases），一旦在alignment这一步被错过，后续的基因融合检测阶段就永远不可能找到TMPRSS2-ERG了。

这便引出了想要给大家推荐的另一个比对工具：BWA-MEM。它是由同一个团队（更具体说，是一个人Heng Li）开发的。BWA原本是用于short-read，但是最新的BWA-MEM可以用于long-read（70bp-1Mbp）。经过在我们项目的Nanopore sequencing数据上检验发现，BWA-MEM可以识别很短的TMPRSS2的exon 1，因此后续的基因融合分析中便可检测到TMPRSS2-ERG这一重要基因融合。

BWA-MEM安装和使用速览

使用GitHub源代码安装

通过Anaconda安装

使用

Indexing

Alignment

存在问题

按照作者的说法，Minimap2和BWA-MEM在功能上差别不大，但是前者比后者快很多（50倍）。并且在我的使用中得到了证实。但是咱做生信分析的，一般都是使用服务器或者超级计算机，那点速度差异在时间维度上真的没所谓（顶多就是程序跑着，先刷个剧再回来看结果呗）。主要还是得因地制宜，看大家研究的侧重点。

文献

Li, Heng. "Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences." Bioinformatics 34.18 (2018): 3094-3100.

Li, Heng, and Richard Durbin. "Fast and accurate long-read alignment with Burrows–Wheeler transform." Bioinformatics 26.5 (2010): 589-595.

Li, Heng. "Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM." arXiv preprint arXiv:1303.3997 (2013).