第二代测序技术

首先简单的说一下二代测序技术，一般简称NGS，新一代测序技术。

1.建库

原理基本如下，将基因组序列采用鸟枪法打碎——俗称建库，然后采用凝胶电泳的方式将不同长度的片段分离，比如现在建库，短库一般建180bp，200bp或者300bp等。这里的180 和300 就是测序片段的长度。当然因为测序仪的读长是固定的，比如110，125，或者450等。公司现在采用的是220bp文库，读长为125bp，因为是双端测序，因此会有30bp的overlap区（这些是后期利用allpath-lg组装的必要条件）。然后大文库测序采用的时环化的技术，同样全基因组鸟枪之后，跑胶，跑出我们需要的相应的长度，比如3k，5k，7k，14k等。得到这些数据之后，再将其打断，然后测序，因为这里有一个环化的过程，所以这里的方向是RF（小文库是FR）。

2.过滤

小文库数据拿到手之后，一般要将质量较低的过滤掉，然后去掉序列两端的接头序列，而大文库处理过滤低质量和过滤掉两端接头序列之外，还要将中间的接头过滤掉。对于过滤大文库接头的程序，我推荐两个，一个是R语言写的Relox，这个要求你指定接头。还有一个就是NXtrim，美国冷泉港开发的一款专门过滤illumina公司的大文库数据接头。

3.评估

做完这些数据处理之后，一般还要对插入片段的评估。插入片段其实就是文库的大小。比如300bp的文库，插入片段就是300bp，但是我们都应该知道在目前的测序水平下，难免会有失误和误差，误差导致的后果是虽然插入片段是300bp，但是只能是平均值是300bp，存在一个方差，大概在几十bp左右。通常误差我们是可以接受的，而对于失误，我们就要把它给找出来，如果插入片段，严重偏离300bp，那么就意味着建库失败。通常我们采用的检验方法是将数据进行基因组组装，组装之后进行soap比对，然后画出比对的效率图。有人会问了难道只能组装完之后才能进行插入片段评估吗？我不知道其他的方式，只能说莫须有。

第三代测序技术

在我还没有完全理解二代测序数据之前，三代测序数据duang的一下子来到了我们面前，措手不及啊。不过三代测序数据原理也是蛮容易理解的。简单的介绍三代数据的特点读段长，超级长，20k以上了，好像。对于三代的原理和数据格式，百度一下，你就知道。我简单说下关于三代，我们要用到的软件。

1.纠错

第一个就是由于三代数据的随机错误很多，因此对数据进行纠错是绕不过去的，介绍两款软件，一款是pacbioToCa，一款是ectool。一个是利用二代数据纠错，一个是利用contig进行纠错。

2.组装

第二个软件就是三代数据的组装，推荐celera Assembly。当然肯定还有其他的牛X的软件，不过正应了高山老师的一句话，牛逼的软件，暂时都没有发表，因此我们很难拿到。对了，多一句嘴，官网说单独用三代组装的话，深度要到40x。

3.混拼

第三个软件是混拼，也就是二代数据和三代数据一起组装。软件为，不废话，官网要求深度为20x。

4.补洞

第四个软件是我喜欢的，就是利用三代数据的长片段来填补二代数据组装完的gao和连接contig为scaffold。推荐软件PBjerry。官网要求深度为5X。

生信是蓝海。