今天给大家分享的是“Distinct hypertrophic cardiomyopathy genotypes result in convergent sarcomeric proteoform profiles revealed by top-down proteomics”（ 基于高分辨率质谱分析法揭示遗传异质性肥厚型心肌病），于近期在线发表在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）杂志山，IF：9.412分。

摘要

背景：肥厚型心肌病是最常见的遗传性心脏病。虽然HCM与编码肌节蛋白的基因突变有关，但根据HCM患者的特定突变预测临床结果的能力是有限的。此外，不同肌节蛋白的突变如何导致高度相似的临床表型的机制尚不清楚。因此，至关重要的是要在蛋白水平上了解该疾病，同时还要关注遗传突变以及调节肌节蛋白的功能的选择性剪接和翻译后修饰（PTM）。

方法及结果：

质谱分析法是蛋白质研究领域和生物大分子研究领域中最重要的分析技术。质谱仪不仅能够检测蛋白质多肽的分子量和氨基酸序列，还能发现蛋白质的结合位点以及翻译后修饰情况。最普遍使用的质谱仪可以分为两类：单联质谱仪和串联质谱系统。单联质谱仪是一种基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器，在鉴别完全测序的基因组蛋白质方面特别成功。串联质谱系统诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于LC-MS/MS（液相色谱法-质谱联用）或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱，以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。其中的LC-MS是一种将高效液相色谱的物理分离能力和质谱的质量分析能力结合起来的分析化学技术。LC-MS可从混合物中测出各种组分并确定其详细结构，是一项具有非常高的敏感度和选择性的分析技术。该方法仅需极少量的样本，在注射相同量的总蛋白之间具有高度的可重复性，可定量比较不同组织的蛋白质组。

作者选取了16例严重流出道梗阻HCM患者的室间隔组织与16例正常供心的左室组织，采用基于高分辨率质谱分析法的蛋白质组学技术，全面观察肌节蛋白表型。作者在HCM组观察到了由于翻译后修饰、选择性剪接和遗传变异引起的多种肌节蛋白表型。其中，肌丝和Z盘蛋白磷酸化水平线性相关，共同降低，提示肌节中存在PTM cross talk和蛋白激酶A通路（protein kinase A pathways）失调。此外，作者发现，无论引起HCM的是何种突变，HCM患者心肌中的肌节蛋白表型改变都是非常一致的。

结论：这项研究表明，尽管突变基因型不同，但重度HCM的表现在蛋白形式水平上基本一致，这突显了HCM表型分子特征的重要性，为寻找广谱治疗以减轻重症表现提出了可能。

研究背景

1、HCM常见致病突变

HCM为最常见单基因突变心肌病，肌节相关基因突变最为常见。

2、HCM基因突变与临床表型

基因突变类型对HCM预后判断无明确临床价值。

3、转录/翻译后改变

转录/翻译后改变对蛋白质合成及疾病发生有重要影响。

研究流程图

研究结果

LC-MS描绘肌节蛋白图谱

为了研究HCM中的蛋白质组，作者分析了HCM患者（n=16）室间隔组织，并与正常供心的左心室组织（LV）（n=16）进行比较。作者使用LC-MS测量了正常和HCM患者组织中的肌节蛋白质组水平，获得了肌节蛋白图谱。

2、 HCM中cTnI和ENH2磷酸化的协同下降

在正常和HCM组织中，作者检测到三种主要的cTnI蛋白形式：未磷酸化（cTnI）、单磷酸化（pcTnI）和双磷酸化（ppcTnI），它们在HCM组织中显著降低，为了确定cTnI磷酸化的特定位点，作者使用电子捕获解离（ECD）进行了超高分辨率MS/MS，锁定了ppcTnI上的磷酸化位点：Ser22和Ser23。重要的是，无论HCM是否引起突变，与正常组织相比，HCM组织中cTnI和ENH2的总磷酸化水平始终降低，并且未磷酸化的cTnI和ENH2始终是HCM组织中检测到的最丰富的蛋白形式。

3、HCM中cTnT、Tpm1.1和MLC-2v的磷酸化改变

作者观察到cTnT的多种蛋白形式，其中，单磷酸化全长cTnT（pcTnT）是观察到的最丰富的蛋白质形式，不到三分之一的cTnT是未磷酸化的。作者量化了cTnT和全长cTnT的磷酸化。与正常组织相比，HCM组织中的cTnT和cTnT总磷酸化平均增加8%和10%。与cTnT相反，与正常组织相比，HCM组织中肌丝蛋白Tpm1.1和MLC-2v的总磷酸化水平降低。未修饰的Tpm1.1和MLC-2v和单磷酸化的pTpm1.1和pMLC-2v蛋白都被检测到。在所有分析的组织中，Tpm1.1总磷酸化水平相对较低。与正常组织相比，HCM切除组织中Tpm1.1磷酸化平均降低23%，MLC-2v磷酸化降低了57%。在所分析的HCM切除组织中，无论HCM引起突变如何，cTnT、Tpm1.1和MLC-2v的总磷酸化水平是一致的。

4、HCM Cypher蛋白磷酸化特征

除了ENH2之外，作者还发现了另一个重要的Z盘蛋白cypher。Cypher由LDB3基因编码，在横纹肌组织中表达，具有许多剪接异构体。作者检测到两种异构体的多个磷酸化物种。在正常和HCM组织中均观察到单磷酸化和双磷酸化的cypher-5（pcypher-5和pcypher-5），而HCM组织也表现出三磷酸化和四磷酸化的蛋白质形式（3pcypher-5和4pcypher-5）。与HCM组织中cypher-5磷酸化明显增加相反，HCM组织中cypher-6磷酸化似乎减少。鉴于之前没有检测到完整的内源性cypher-5和cypher-6，作者接下来使用超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）MS/MS分析确定了这些亚型的序列，获得cypher两个亚型N端和C端的直接序列证据。作者通过结合ECD和碰撞活化离解（CAD）实验观察到与未磷酸化cypher-5的117/348蛋白质骨架键裂解相对应的片段，序列覆盖率为34%。通过ECD和CAD联合实验，获得了57%的未磷酸化CYPHR-6的序列覆盖率，占起始剂甲氧九裂解和N端乙酰化DNA预测序列的160/281蛋白骨架裂解。

总结

该研究采用了一种基于LC-MS的蛋白组学方法，从HCM和正常心脏组织中鉴定和定量心肌肌节蛋白组。作者揭示了一个复杂的蛋白组结构，并解析了重要Z盘蛋白的蛋白质组。分析显示HCM心肌组织中肌节蛋白与正常组织的的磷酸化差异。HCM组织cTnI和ENH2磷酸化降低与正常组织的磷酸化程度呈较强的线性相关，提示HCM中PKA信号的调节失调，肌丝与Z盘蛋白PTM的相互作用不正常。需要注意的是，该研究存在一定局限性，队列只包含部分HCM基因突变（MYH7或MYBPC3），并没有囊括所有基因突变的HCM患者。另外，作者只取材了晚期流出道严重梗阻患者的心肌组织，并不能很好的反映早期HCM的肌节蛋白形式。综上，该研究表明，尽管MYH7或MYBPC3中存在不同的肌节基因突变，但会聚途径仍能激活，从而导致阻塞性HCM患者肌节蛋白组形态与类似临床表型一致的改变。作者强调了HCM在蛋白质组水平上的分子表征对于了解表型表现和潜在的功能失调信号通路的重要性，未来的蛋白质组学研究将涵盖广泛的HCM表型，有助于根据蛋白质组的形态来定义疾病进展和预后。