2023年8月，名古屋大学医学部和岐阜大学医学院在内的多家科研院校在期刊J Immunother Cancer(IF=10.9）发表了题为“Single-cell sequencing on CD8+ TILs revealed the nature of exhausted T cells recognizing neoantigen and cancer/testis antigen in non-small cell lung cancer”的文章，作者对CD8免疫浸润淋巴细胞进行了scRNA-seq和scTCR-seq，以阐明手术切除的非小细胞肺癌（NSCLC）中的肿瘤内T细胞状态，并且通过表型和TCR分析研究了肿瘤特异性T细胞群，以及它们对突变衍生的新抗原和一种代表性癌症/睾丸抗原（cancer/testis antigens，CTA）的反应。

研究背景

肺癌是对免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICI）最敏感的癌症之一，但只对部分患者有效。因此，迫切需要开发新的治疗策略和/或生物标志物来更有效地进行肺癌的免疫治疗。

细胞毒性CD8+ T细胞（Cytotoxic CD8+ T cells，CTLs）是介导抗肿瘤反应、清除肿瘤细胞的重要免疫细胞，而突变衍生的新抗原可能是ICI重新激活CTLs的重要肿瘤特异性靶点，肿瘤特异性T及其抗原的识别可能会指导基于抗原的免疫治疗策略的设计和抗肿瘤免疫反应的生物标志物的开发。最近，单细胞测序在几种不同的癌症中发现了不同的肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs），并表明某些T细胞表型可能与特定TCR序列的表达和特定肿瘤抗原的存在有关。

研究结果

患者特征

作者选择免疫评分高、CTA和KK-LC-1基因阳性的非小细胞肺癌（non-small cell lung cance，NSCLC）患者，包括两名患者患有鳞癌，一名患有腺癌（表1）。流式细胞仪分析发现表达PD-1或CD39和CD103的CD8+ T细胞已经渗透到肿瘤中。

表1 患者特征

scRNA-seq确定CD8+ TIL表型聚类

scRNA-seq和scTCR-seq表征CD8+ T细胞的表型和克隆性，根据T细胞相关基因表达，将6998个CD8+ T细胞分为10个簇（B-D）。伪时序分析表明CD8+ T细胞的分化遵循从幼稚T细胞到耗竭T细胞的特征轨迹（E）。层次聚类将CD8+ T细胞分为“耗竭”（增殖性T细胞（Tprol），耗竭T细胞（Tex））和“非耗竭或幼稚”（记忆T细胞（Tm），效应T细胞（Teff）和幼稚T细胞（Tn））两种类型（F）。TeX簇的特征是ENTPD1（CD39）和T细胞耗竭标记基因如PDCD1（PD-1）和HAVCR2（TIM3），效应分子基因GZMB、GZMK、PRF1和IFNG的表达，以及转录因子TOX17的表达(G)。

图 1 scRNA-seq确定CD8+ TIL表型聚类

CD8+T细胞簇的TCR谱系分析

对3例患者的2480个TCR克隆型进行TCR测序分析，总的以及每个患者中Tm和Tn的克隆类型数量最多（A上）。Tex中表达不同CDR3β的T细胞的比例（克隆类型数/克隆数)较低（A下)，表明该簇具有较高的寡克隆性程度。Shannon多样性指数也显示Tex簇细胞的TCR多样性较低（B），Tex细胞中的TCR在很大程度上与Tprol中的TCR重叠（C）。

图 2 CD8+T细胞簇的TCR谱系分析

CD8+T细胞识别的肿瘤抗原

为了研究肿瘤特异性CD8+ T细胞群，在患者1的每个细胞群中按频率从高到低选择至少两个TCR亚型，一共得到70个TCR亚型，包括3个Tem-TCRs、3个Tact-TCRs、43个Tm-TCRs、1个Tn-TCR、1个γδ样T-TCR、1个NK样TCR和18个Tex-TCRs。根据错义突变合成了41个预测的新抗原和14个KK-LC-1多肽。不过仅在四个Tex-TCR TAP/Luc-Jurkat细胞中记录到特异性反应（A），还发现两个不同的Tex-TCRs（ex06和ex09）对新抗原（SORL1 pS385F）具有特异性，而另外两个Tex-TCRs（ex08和ex15）对HLA-B*15:01-restricted KK-LC-1肽具有特异性（B）。

所有针对肿瘤抗原的T细胞在患者1的Tex簇中发现，所以作者对患者2和3的分析，也主要关注Tex簇。在患者2中发现3个Tex-TCRs（ex08、ex09和ex12）在这个病例中介导应答（C、D）。患者3中有2个Tex-TCRs（ex02和ex11）介导阳性反应（E、F）。

总的来说，发现了来自三个患者的9个不同的TCR克隆类型和5个同源肿瘤抗原。所有确定的TCR克隆（n=140）都被映射到UMAPs上（G）。Tex簇中相同的TCR克隆类型也存在于Tprol、Tem、Tact、Tapop(凋亡性T细胞)和NK样细胞簇。

图 3 CD8+T细胞识别的肿瘤抗原

CD8+ T细胞中对新抗原、CTA和病毒抗原应答的基因表达分析

为了确定肿瘤抗原特异性T细胞的特征，作者首先将其与作为旁观者T细胞渗透到肿瘤中的病毒特异性T细胞进行比较。发现大多数这样的T细胞位于各种未耗竭的T细胞簇（A）。差异表达分析比较了肿瘤抗原特异性T细胞（n=140）和病毒特异性T细胞（n=19）的基因表达，发现耗竭T细胞相关基因主要在肿瘤抗原特异性T细胞中表达（B）。

比较对不同肿瘤抗原（CTA、KK-LC1或新抗原）有反应的T细胞之间的基因表达谱(C)，没有发现差异表达的基因（D）。不过，MSigDB V.2022.1.HS基因集的GSEA分析显示对新抗原产生反应的T细胞中富含与T细胞信号、激活、增殖和细胞因子产生相关的基因，而对CTA反应的T细胞中不富含（E）。

图 4 CD8+ T细胞中对新抗原、CTA和病毒抗原应答的基因表达分析

肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的分化和功能状态

作者对140个T细胞克隆进行重聚类，发现分为两个簇，“effector-like”和“progenitor-like”（A）。CTA特异性T细胞中“progenitor-like”比例高于新抗原特异性T细胞。为了阐明每个肿瘤抗原特异性T细胞的分化状态，作者研究了140个重聚类的T细胞和6998个CD8+ T细胞在已有研究中发现的耗竭相关基因的表达（B）。层次聚类分析也表明即使在同一个Tex簇中，单个T细胞克隆也具有不同的分化和功能状态（C）。

根据识别的肿瘤特异性抗原的性质，发现祖细胞标记TCF7，中间或预耗竭T细胞标志物CXCR1、终末耗竭标记CD101等在不同的特异性T细胞中高表达（D）。综上所述，每个肿瘤抗原特异性T细胞的分化状态是不同的。

图 5 肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的分化和功能状态

TCR信号强度及其与T细胞分化和功能的关系

为了阐明TCR信号强度与T细胞分化和功能的相关性，作者使用NFAT报告荧光素酶分析每个TCR克隆型对各自肿瘤抗原的亲和力。9个Jurkat-TCR细胞拮抗5种抗原的logEC50值从1.976到4.175（A），而巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）pp65抗原为0.9782。在针对不同肿瘤抗原的TCR中，针对突变的ITGB5的TCR表现出最高的功能反应（A，B），而具有高亲和力TCR克隆倾向于终末耗尽T细胞的命运。因此，突变的ITGB5特异性T细胞可能最接近终末耗竭，CD101的表达也证明了这一点（E）。

最后，作者研究了具有9种TCR克隆型的细胞外TCR信号和细胞内T细胞特征的相关性。TCR信号强度与WNT信号通路、颗粒酶介导的细胞程序性死亡、T细胞增殖、干扰素应答和肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生呈现中度相关（C）。但对于这些基因特征，新抗原特异性T细胞的z分数是可变的但显著高于KK-LC-1反应性（D），与GSEA结果一致（E）。

图 6 TCR信号强度及其与T细胞分化和功能的关系

小结

研究目标：识别更广泛的肿瘤抗原，阐明肿瘤抗原特异性T细胞的性质，从而为基于抗原的免疫治疗确定有希望的新治疗靶点。

研究样本：选取免疫评分高、CTA和KK-LC-1基因阳性的NSCLC患者进行scRNA-seq和scTCR-seq。

研究思路：单细胞降维和聚类识别CD8+ T细胞亚群；TCR测序分析细胞亚群的克隆多样性，通过TCR亚型识别肿瘤抗原，发现肿瘤特异性CD8+T细胞群；基因表达、功能分析和分化状态分析来确定肿瘤抗原特异性T细胞的特征；最后通过阐明TCR信号强度与T细胞分化和功能的相关性来验证前面的结论。

总而言之，这篇文章的创新性和故事性极强，值得大家细细品味。