Title：结直肠癌和胰腺癌放疗对免疫治疗的影响 

难治性结直肠癌和胰腺癌放射诱导的检查点免疫治疗反应

大家好，今天给大家分享的是去年9月的一篇文章。免疫检查点阻断在微卫星稳定(MSS)结直肠癌(CRC)和胰腺癌(PDAC)中的疗效有限，这项研究主要描述了在MSS CRC和PDAC中联合抗CTLA4和抗PD1抗体的放射治疗2期试验，该研究为放射和联合免疫检查点阻断治疗在其他免疫疗法抗性癌症中的概念提供了基本的证据。

方法部分

病人选择

本研究共纳入40例CRC患者和25例PDAC病患者()。所有患者都被确认为MSS，并且在入院时有转移性疾病。

全外显子组测序(WES)分析

WES共分析了来自每个方案队列17名患者的41例具有配对胚系DNA的肿瘤样本，在HiSeqX上使用双末端读长对样品进行测序。研究者从双末端wes读长检测获得了SNV和indel突变，其read长度为150个碱基对，并根据GATK最优流程对测序读长进行了预处理。具体来说，首先使用bwa和samtools将测序读长与人类参考基因组(GRCh37)进行比对，并使用picard的"MarkDuplicates"来标记重复。使用GenomeAnalysisTK工具进行indel重比对，使用BaseRecalibrator和dbSNP重新校准了碱基质量。最后，基于预处理之后的序列数据，研究者使用MuTect和Strelka检测SNV和indel。然后，使用bam-readcount软件执行每个SNV和indel的检测以获取正常/肿瘤读长count值。除了可能的KRAS突变之外，其余突变也都使用了最小碱基质量过滤阈值"-b 15"，这是为了捕捉所有可能的司机KRAS突变。检测出来的所有突变使用snpEff进行注释。研究者对所有突变，非同义SNV突变和错义突变分别计算了肿瘤突变负荷(TMB)。变异等位基因频率大于10%的编码突变被视为"高质量"的突变。

RNA-seq计算分析

在Illumina NextSeq 500平台上进行双末端测序，原始Illumina读长经过如下步骤质控。首先，对读长的末端进行修剪，去除质量小于20的N和碱基。这之后，对剩余碱基的质量分数进行排序，并计算第20百分位的质量，如果第20百分位的质量小于15，则整个读长被丢弃。此外，修剪后少于40个碱基的读长被舍弃。如果这一对中至少有一个读长没有通过质控，其配对的读长同时被丢弃。使用STAR将经过质控的读长比对到人类基因组，随后使用Rsubread软件包的featureCounts工具将比对上的读长映射给基因，这就产生了每个基因的原始read count值。使用R中的DESeq2包进行差异表达和统计分析，以未标准化的原始read count值作为输入，使用FDR校正的p值<0.05来选择差异表达基因，通过Kaplan-Meier方法来可视化OS和PFS曲线。

结果部分

免疫检查点抑制和放射联合治疗的疗效

在CRC队列中，大多数患者(N=23，58%)在诊断时是转移性的，从诊断到第1周期第1天的中位时间是44.9个月(表1)。在PDAC队列中，大多数患者(N=18，72%)在诊断时为局部晚期或转移性，从诊断到第1周期第1天的中位时间为16.9个月(表1)。  

表1 基线患者和疾病的特征

在入组并开始治疗的40名CRC患者中，疾病控制率(DCR)为25%，通过意向性治疗(ITT)分析，客观缓解率(ORR)为10%。CRC队列的中位PFS为2.4个月，中位OS为7.1个月(a,b)。同样，根据ITT分析，25名PDAC患者的DCR为20%，ORR为12%。中位PFS为2.5个月，中位OS为4.2个月(a,b)。共有34名患者接受了光子治疗，12名患者接受了质子治疗。在这两个队列中，32%的患者(CRC13/40；PDAC8/25)因自身免疫毒性导致临床衰退(N=4)、临床进展(N=7)而在放射治疗前停药(表2)。

表2 最佳总体反应的疗效

在CRC队列中，83%的患者出现了≥3级的不良事件(AE)，60%为3级，20%为4级，3%为5级。最常见的≥3级AE是淋巴细胞减少症、脂肪酶或淀粉酶升高、贫血、腹泻、结肠炎、低钠血症和疲劳，5级毒性是肺炎(表3)。在PDAC队列中，60%的患者出现了AE≥3级，44%为3级，12%为4级，4%为5级。最常见的3级AE是淋巴细胞减少症、疲劳、高血糖和肝功能测试升高，5级毒性是肝性脑病，可能与治疗有关(表3)。

表3 与治疗相关的不良事件

在对接受放疗的患者进行的实验方案分析中显示，CRC队列的DCR为37%，ORR为15%；PDAC队列的DCR为29%，ORR为18%。显示了CRC和PDAC的最优客观缓解，如瀑布图所示。一个CRC和一个PDAC病例的完全缓解(CR)非常明显。癌症患者队列的中位PFS为2.5个月，中位OS为10.9个月(c，d)。10名疾病控制为最佳总疗效的患者的中位PFS为5.2个月，而17名没有疾病控制的患者的PFS为2.4个月。相比疾病未控制者的中位OS为7.7个月，疾病控制者的中位OS为20.9个月。在PDAC队列中，中位PFS为2.7个月，中位OS为6.1个月。5名疾病控制为最佳总疗效的患者的中位PFS为5.5个月，而12名疾病未控制患者的PFS为2.5个月。

肿瘤突变负荷及编码基因突变分析

通过WES分析了来自每个实验方案队列17名患者的总共41例肿瘤样本。所有患者的TMB都很低(a)，无缓解的患者(疾病进展=PD)与缓解的患者(疾病稳定=SD，部分反应=PR，完全反应=CR)相比没有区别。此外，TMB在治疗前、治疗中和治疗后都没有变化(a)。对非同义基因突变的分析确定了突变的常见基因，包括CRC和PDAC的KRAS和TP53突变，以及CRC的常见APC突变(b)。此外，DNA损伤和修复通路基因也存在显著突变。没有特异的DNA损伤和修复通路基因突变在有反应或疾病稳定的患者中出现。值得注意的是，4号患者(CRC PR)和41号患者(PDAC CR)有6个DNA损伤和修复基因的突变，这表明这些基因在预测反应方面有潜在的重要性。

与疾病控制相关的重复RNA表达和干扰素反应基因

对13例接受放射治疗患者的32份样本进行了RNA测序分析。活检分析显示，与无缓解的患者相比，缓解的患者中有467个差异表达基因，其中315个上调，152个下调(a)。缓解者中上调基因的基因集富集到HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE中。放疗前和放疗后样本的配对分析显示，所有患者中有372个基因上调，209个基因下调。有趣的是，最显著富集的基因基还是HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE，这表明干扰素γ应答基因在放疗诱导的免疫反应生物活性中的重要性。放射诱导的显著基因包括多种MHC I类、MHC II类和重要的炎性细胞因子，这表明放射肿瘤中抗原呈递增强(b)。使用免疫细胞转录特征对RNA-seq数据中的免疫亚群进行去卷积，发现M2巨噬细胞占主导地位，而CD8 T细胞却很少。放疗前缓解者的样本中树突状细胞(DC)的丰度高于无缓解者，并且放疗后树突状细胞的总体丰度增加，这在无缓解者中更明显。此外，与放射后相比，所有患者在治疗前都观察到NK和CD8细胞丰度的增加，且在缓解者和无缓解者中，放射前和放射后的初始和记忆CD4 T细胞的比例可能发生变化。考虑到缓解者先天免疫应答较高的指征，研究者分析了RNA-seq的重复元件RNA表达水平，缓解者与无缓解者相比，147种重复RNA的水平异常地高，只有9个重复RNA的水平较低(c)。对主要重复元件的分析发现，与进展者相比，疾病控制患者的HERV-K内源性逆转录病毒的表达明显较高(d)。总的来说，干扰素应答失调相关重复元件的去抑制与接受放射联合免疫检查点阻断患者的疾病控制和应答相关。

参考文献：Radiation Induced Checkpoint Immunotherapy Response in Refractory Colorectal and Pancreatic Adenocarcinoma