1.4文库制备

在测序前，需要将样品中的所有RNA分子转化为cDNA。执行这一步是因为在实践中RNA分子不能直接测序（如今Nanopore三代测序技术可以了），而是由具有化学稳定性更好的DNA进行测序，并且更适合于每个测序平台的测序化学原理和要求。因此，文库制备有两个目的，第一个是如实的代表样品中的RNA，第二是将RNA转化成DNA。每个RNA测序平台（例如，Illumina，Solid，Ion Torrent，BGISEQ-500）都具有其自己特定要求，均可以在相应的公司网站上找到。

附：BGISEQ-500官网:http://www.seq500.com/.

第三方文库制备工具也可以使用，并已经取得了一定的成功。尽管这缺乏商业产品的便利性，优化和支持，但可以使用常用的分子生物学组分来创建自己的工具。下图我们展示了Illumina的RNA-seq平台典型的文库制备步骤。

文库制备的主要包括以下步骤：

1.获取约1-10μg纯的，完整的经过质量核查的全部RNA。确切的数量需要取决于应用程序和平台。

2.从全部RNA中纯化mRNA。通常，这是通过将全部RNA退火到oligo-dT 磁珠上来完成的。可以进行两轮纯化，以从oligo-dT 中去除非特异性结合的核糖体和其他RNA。然后从oligo-dT 磁珠释放或分离mRNA。

3.使用fragmentation reagent对纯化mRNA进行片段化处理，将mRNA链断裂成多个小片段。

4.用随机六聚体引物对片段化的mRNA进行检测。

5.用逆转录酶逆转录片段化的mRNA，从而产生cDNA。

6.合成cDNA的第二/互补链并除去mRNA。产物是双链cDNA（ds cDNA）。

7.从游离的核苷酸，酶，缓冲液和RNA中纯化双链cDNA。例如，可以通过将DNA与固相可逆固定（SPRI）珠结合来完成。使用这些顺磁珠的优点是一旦结合，可以通过洗涤顺磁珠来纯化残留在珠上的双链 cDNA。双链 cDNA从珠上洗脱后就可以进入下一步反应。

8.在纯化的洗脱双链cDNA上进行末端修复。

9.纯化末端修复的双链cDNA。这也可以在SPRI珠上完成。

10.洗脱末端修复的双链 cDNA的腺苷酸3'末端。

11.将衔接子连接到末端修复的双链 cDNA上。衔接子将连接到双链cDNA的两端。这些衔接子可以为每个文库反应编制索引（index）。换句话说，每个衔接子在衔接子序列中可以有6个核苷酸的差异。对每个文库反应使用不同的索引允许稍后将文库合并用于测序，也允许基于衔接子序列将序列追溯回原始文库。

12.将衔接子连接的末端修复的双链 cDNA纯化。这可以用SPRI珠来完成。

13.通过聚合酶链式反应（PCR）扩增富集文库。使用来自衔接子的序列作为引物，使用少量循环（12-16）来扩增已经存在的序列。

14.纯化PCR富集的，衔接子连接的，末端修复的双链 cDNA。同样，这可以用SPRI珠来完成。此时，这就是代表样品中原始mRNA的文库。

15.确保文库的质量和质量。这可以通过以下几种方式完成：

（1）通过应该存在于文库中的PCR特异性基因选择性扩增;

（2）量化文库中双链cDNA的产量;

（3）通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或安捷伦生物分析仪上的毛细管电泳使文库的丰度和大小分布可视化。

16.标准化及合并文库。

由于在单个流动池中进行测序的能力是巨大的，因此可以对多个文库进行测序（最多24个文库/流动池，更常规的是6-12个）。标准化起到平衡每个文库中双链 cDNA的量的作用。例如，所有的文库可以稀释到10nM 双链 cDNA，然后以均匀的体积合并，使得每个文库均等地代表最终的文库。

17.将标准化及合并后的文库发送到依赖于特定平台（Illumina，Solid，454等）的测序工具

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