1.BioProject 号和 BioSample 号

对某一个物种进行了基因组测序，则申请 BioProject 和 BioSample 号各一个。

2. 使用 tbl2asn 准备后缀为 .sqn 的 ASN.1 文件

在 windows 下可以使用 Sequin 来制作 .sqn 文件。该文件是下面所述的 3 个文件的信息的综合体。tbl2asn 是命令行的工具，适合大基因组数据的 .sqn 文件生成。

3. 生成包含作者信息的 .sbt 模板文件(Submission Template)

推荐使用网页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/template.cgi，填入数据生成 template.sbt 文件，并下载到本地。当然，此文件也可以使用 Sequin 生成。填写信息时，可填入 BioProject 和 BioSample 号。

4. 准备后缀为 .fsa 的fasta文件

fasta 文件的的 header 要求如下：

1. ">" 和 第一个空格之间的内容是序列名。

2. header部分可以加入其它因素，比如：

organism [organism=Saccharomyces cerevisiae]

strain [strain=S288C]

isolate [isolate=CWS1] # 代表在什么个体上获得的样品

chromosome [chromosome=XVI]

topology [topology=circular]

location [location=mitochondrion]

molecule [moltype=mRNA] (DNA is the default)

technique [tech=wgs]

protein name [protein=helicase]

genetic code [gcode=4]

5. 准备后缀为 .tbl 的表格格式的基因组注释信息文件

此文件有 5 列，每列用 tab 分割，称为 feature table。此文件是最为关键的一步。该文件必须包含：编码基因的结构注释信息、非编码基因的结构注释信息 和 基因的功能注释信息。一旦做不好，NCBI的工作人员就会发email反馈修改意见。feature table 格式的要点如下：

1. 对每条序列的所有注释之前，有一行额外的内容，例如：

>Feature scaffold_1

该行内容后面的所有注释信息属于序列 scaffold_1 ，一定不能遗漏 Feature 这个单词，Feature 和 scaffold_1 用空格分隔。

2. 每个 feature 使用 5 行内容进行阐述，并分成 2 个部分。

第 1 部分是 feature 在序列上的结构信息。有 3 列，分别为该 feature 的起始位点、结束位点和 feature 名。若 feature 在正义链上，则起始位点 < 结束位点，若在负义链上，则起始位点 > 结束位点。若 feature 为断裂基因的 CDS 或 exon 等信息时，则有多行数据，但仅在其首行的第 3 列上显示 feature 名。

第 2 部分是 feature 的功能注释信息。使用第 4、5 列，前面有 3 个 tab 键。第 4 列对应 feature 的 qualifier，第 5 列是 qualifier 的值。 qualifier 是对 feature 的描述标签。如果有多个 qualifier 及其值，则用多行进行表示。

3. feature 和 qualifier 的具体标签名称参考http://www.insdc.org/documents/feature_table.html。

4. 常用的 feature 名称有：gene, mRNA, CDS, exon, 5'UTR, 3'UTR, tRNA, rRNA, ncRNA 等。其中 ncRNA 是指除了 tRNA 和 rRNA 以外的其余 ncRNA。

5. gene 的 qualifier 标签一般是 gene, 第 5 列使用 NCBI 提供的 locus_tag + 数字编号。 mRNA 和 CDS 的 qualifier 标签一般使用 product，第 5 列是 Nr 注释的结果。exon 的 qualifier 标签一般使用 number，其值为 1,2,3... 。 UTR 的 qualifier 标签可以使用 note。 tRNA 的 qualifier 标签一般使用 product，第 5 列是 tRNA 名称, 例如 tRNA-Lys。rRNA 的 qualifier 标签要有 gene 和 product，第 5 列中product 是 "16S ribosomal RNA", "23S ribosomal RNA", "5S ribosomal RNA", 相应的 gene 的值可以是 rrsA, rrlA, rrfA ... , rr 表示是 rRNA， s l f 分别对应 16 23 5, A是一个编号，下面的编号是 B, C D... 此外，每个 rRNA 区域要有个 gene 的 feature。 ncRNA 的 qualifier 标签中必须有 ncRNA_class，第 5 列则是 ncRNA 的类别，比如 miRNA, siRNA, scRNA 等。此外，可以使用 note 作为 qualifier 的标签，其值可随意标示。

6. mRNA 和 CDS 的 product 的取值，使用 Nr 注释的最优结果。最优结果如果包含 "hypothetical protein" 、 "predicted protein" 、 "unknown" 、 "partial" 或 "homolog" 时，则需要取其它注释结果，或采取一定的措施了。

6. tbl2asn 命令生成 .sqn 文件

在当前目录下生成了 3 个文件: species.sbt, species.fsa, specis.tbl 。运行 tbl2asn 生成目标文件 species.sqn 。

tbl2asn -t C001.sbt -p ./ -a s -V vb

# -a s 一个fasta文件有多条序列时，使用此参数配置。

# -V vb v表示对输入的数据进行验证，生成 2 个 .val 的文件；-b 生成GeneBank格式的文本文件，以 .gbf 为后缀。

# 运行完毕后需要查看 val 文件，其中可能有很多错误与警示信息。 有些蛋白质序列不是以 M 开头，会在此处提示 ERROR 。特别是细菌基因组会出现这样的提示。应该在 .fsa 文件的 header 部分加上 [gcode=11] 来解决。表明其遗传密码子表是 11 号。根据错误，去除所有的错误提示。

7. 使用 GenomeMacroSend 上传 .sqn 文件

在 GenomeMacroSend 网页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/GenomeSubmit/genome_submit.cgi 的最下方的输入框中填写信息上传 .sqn 文件。

8. 全网页方法上传数据

基因组数据上传：Genomes(WGS) submission portal转录组数据上传：TSA submission portal使用网页方式上传数据和上述方法基本一致。 feature tab 的制作依然需要自己手工制作，再上传。

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