各位小伙伴大家好！今天给大家分享一篇中山大学肿瘤防治中心杨群英老师今年6月发表在Cancer Sci（IF=5.7）上的文章。作者联合原发性多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）和复发性GBM的scRNA-seq数据来比较原发性和耐药性GBMs中癌细胞的转录组景观及肿瘤异质性和肿瘤微环境，并进一步探究GBM的耐药机制。

研究背景

GBM是最具侵袭性和致命性的原发性肿瘤，具有广泛的瘤间和瘤内异质性。GBM的复发不可避免，而肿瘤复发与肿瘤异质性和肿瘤微环境（TME）有关，而且这两种因素在耐药性中起着关键作用。但是目前对复发性GBM的肿瘤异质性、TME和分子特征的了解还很有限。

研究结果

结果一：复发性GBM图谱构建

对三例复发性GBM和三例原发性GBM患者的肿瘤样本（TISCH数据库）进行scRNA-seq分析，探究GBM TME细胞组成（A）。来自原发性IDH野生型GBM的10144个细胞和来自复发性GBM的19982个细胞分成了22个细胞群（B）。根据经典细胞marker鉴定了11种主要细胞类型，并将其分为肿瘤细胞类型、内皮细胞类型和免疫细胞类型（E）。应用inferCNV算法分析了参考细胞（内皮细胞）和观察细胞（免疫细胞和肿瘤细胞）中每个细胞的CNV来探究复发性GBM细胞的克隆结构。构建的参考CNV图谱揭示了患者间和患者内的异质性（F）。

图 1 原发性和复发性胶质母细胞瘤的细胞组成概况

结果二：肿瘤异质性和细胞亚群鉴定

作者对肿瘤细胞进行重聚类，共发现了16个亚群（C）。发现这些簇在不同样本中差异很大，作者推测可能是由于肿瘤表型或肿瘤内活检位置的不同造成的。其中第4、13和14簇在原发性GBM细胞中占主导地位，第0和12簇在复发性GBM细胞中占主导地位（E）。归一化Shannon diversity index用于显示每位患者主要聚类的均匀度（D）。

图 2 原发性和复发性GBM瘤患者肿瘤细胞的细胞概况

为了进一步确定肿瘤细胞类型，作者使用经典细胞marker对进行聚类和注释（B）。一共确定了九种肿瘤细胞亚型，分别为星形胶质细胞、CGEin、分裂的少突胶质前体细胞（OPCs）、未成熟星形胶质细胞、小鼠干扰素α产生细胞（mIPCs）、新生神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、OPCs和放射状胶质细胞（A），并且每个患者都存在几乎所有的细胞亚群。复发性GBM和原发性GBM患者之间和样本内部的细胞类型比例不同且具有显著差异（C、D）。在原发性GBM中，CGEin、未成熟星形胶质细胞和小胶质细胞的比例较高；但在复发性GBM中，少突胶质细胞的比例较高（E）。不同病灶中细胞亚群的比例差异很大，这表明瘤间异质性以及病灶间的异致性。为了探究复发性GBM TME中细胞类型之间的相互作用，作者使用CellPhoneDB进行了细胞-细胞互作分析，发现分裂的OPCs、OPCs、未成熟星形胶质细胞和少突胶质细胞之间存在显著的相互作用（F）。

图 3 样本中每种细胞类型的丰度和均匀度

结果三：复发性GBM的发育轨迹和增殖相关肿瘤群的识别

根据Monocle3算法对复发性GBM进行了轨迹分析，以推断发育轨迹。分裂的OPCs被确定为生物过程的起点（A）。KEGG通路分析显示，簇12富含干细胞信号通路（B）。而且细胞增殖相关基因，包括TOP2A、MKI67、UBE2C、CENPF和PBK，都富集在簇12中，这意味着表型向恶性转变（C）。通过细胞周期评分发现复发GBM中处于G1期和S期的细胞数量多于其他阶段（D）。作者还发现CGGA（数据库）胶质母细胞瘤患者队列中，具有高放射状胶质细胞特征的患者比具有低放射状胶质细胞特征的患者的总生存期（OS）长，而且复发的次数也在增加（E-G）。

图 4 复发性GBM的发育轨迹和增殖相关肿瘤亚群的识别

结果四：复发性GBM的耐药机制

作者采用双侧Wilcoxon检验比较原发性和复发性GBM中的差异表达基因（DEGs）（A）。作者发现VEGFA在复发性GBM中高表达，而且主要是在放射状胶质细胞中（B、C）。高级别胶质瘤的高代谢需求会产生缺氧区域，从而引发VEGF表达和血管生成增加，导致异常血管和血脑屏障（BBBs）功能失调。此外，作者还发现复发性GBM中富集了与MGMT相关的信号通路（E）。与原发性GBM相比，复发性GBM的放射状胶质细胞特征和MGMT基因表达明显增加，且与预后不良相关（F,G）。免疫组化和免疫荧光染色进一步证实了复发性GBM中小胶质细胞减少和VEGF蛋白表达的增加（）。

图 5 识别GBM中与耐药性相关的肿瘤细胞亚群

图 6 原发性和复发性GBM中小胶质细胞数量和VEGF蛋白表达的变化

讨论

复发性GBM细胞的基因表达程序与原发性GBM细胞不同，具有瘤内异质性。作者利用scRNA-seq在复发性GBM中发现除了0、1和14簇之外的几乎所有细胞亚群中都检测到了VEGFA的过表达。TME的重塑反过来又会增加VEGFA的表达，从而刺激血管生成并支持胶质母细胞瘤的生长。而先前的研究表明血清VEGFA水平与贝伐珠单抗的治疗效果之间存在负相关。作者还提出了抑制癌症增殖、恢复癌症免疫循环和克服免疫抑制微环境的潜在治疗靶点:作者提到尽管GBM核心区的BBB被认为是“渗漏”的，但在核心区以外的大部分区域和低级别弥漫性胶质瘤中的BBB更接近于完整的BBB，可以阻止癌症治疗药物（包括小分子和抗体）的有效通过。不过，作者发现复发性GBM的BBB是“渗漏”的，而且目前唯一已知的GBM患者替莫唑胺（TMZ）反应的生物标志物MGMT相关信号通路基因在预后不良的复发性GBM中富集。

结论

肿瘤异质性与肿瘤的内源性耐药性有关，大多数报道的耐药性机制已通过分析bulk数据和/或耐药细胞系确定。但是作者通过联合复发性GBM和原发性GBM的scRNA-seq的研究确定了GBM TME特有的细胞和生物学特征，从而提供了可能有助于确定新的治疗靶点的见解。

总结

作者对3个复发性GBM患者进行单细胞转录组测序，并在公共数据集下载了3个原发性GBM患者的scRNA-seq数据作为对照，从而构建了复发性GBM的单细胞转录组谱图。鉴定出肿瘤细胞、内皮细胞和免疫细胞，并通过inferCNV算法鉴定出恶性细胞，进而探究GBM的个体特异性和瘤内异质性。

然后，作者提取癌细胞并进一步鉴定癌细胞的组成来分析GBM TME的异质性。通过Cellphone DB分析GBM TME中细胞的互作关系。

随后，作者对识别的癌细胞的细胞亚群进行轨迹分析和功能富集分析，来鉴定可能或已发生恶性转变的细胞亚群。进一步通过CGGA胶质母细胞瘤患者队列中比较具有高放射状胶质细胞特征的患者比具有低放射状胶质细胞特征的患者的总生存期和复发的次数。

最后，作者通过对原发性GBM和复发性GBM进行差异分析，识别到复发性GBM中的高表达基因及主要表达这些基因的细胞亚群，进而分析这些基因影响到的通路和与预后的关系，从而阐明GBM的耐药机制，并通过湿实验加以验证。

看到最后，我们可以发现作者的设计环环相扣、层层递进，故事性也很强，是一篇值得仔细研读的文章。