单细胞RNA-seq和大体RNA-seq的综合分析揭示了三阴性乳腺癌中与T细胞相关的预后风险模型和肿瘤免疫微环境调控机制

各位小伙伴大家好！今天给大家分享一篇北京中医药大学中药学院吴嘉瑞教授团队今年7月发表在Computers in Biology and Medicine（IF=7.7）上的文章。文章联合公共数据集的bulk和scRNA-seq数据，利用轨迹分析、富集分析、细胞间通讯分析等多重策略探究了三阴性乳腺癌（Triple negative breast cancer，TNBC）中T细胞的异质性，进而根据T细胞的marker基因在bulk RNA-seq队列中构建预后模型，并分析TNBC免疫浸润的程度。

研究背景

三阴性乳腺癌是一种缺乏孕酮受体（Progesterone receptor，PR）、雌激素受体（Estragen receiver，ER）和人类表皮生长因子受体2的侵袭性乳腺癌。TNBC患者的肿瘤内部异质性大，侵袭能力强，临床预后较其他亚型更差，生存率更低。但是目前针对已发生转移的TNBC患者的新辅助化疗方案的中位总生存期较短。作者通过对T细胞、bulk RNA-seq和临床数据的综合分析，描述了TNBC的肿瘤免疫微环境以及T细胞与临床预后之间的关系（）。

图 1 研究流程

研究结果

结果一、TNBC的细胞组成

10个TNBC样本的25932个细胞分为14个簇并根据CellMarker数据库和文献收集的marker基因注释为7种细胞（）。

根据文献的marker基因，将T细胞分为：高表达IL7R、FOXP3和CCR7的CD4+ T细胞；高表达GZMH、CD8B和CD8A的CD8+ T细胞（）。

图 2 TNBC的scRNA-seq的整合和聚类

图 3 T细胞亚群图谱

结果二、T细胞的细胞间互作分析

为了探究T细胞与其他类型细胞的细胞间互作特点，作者使用Cellchat分析细胞亚群间互作的潜在配体-受体对（）。作者发现细胞间相互作用主要存在于MIF信号通路中（MIF-CD74+CXCR4和MIF-CD74+CD44）（D），其中配体-受体对MIF-CD74+CXCR4对该通路的贡献最大（E）。基因ACKR3和CXCR2的表达也与这一信号通路有关（F）。

图 4 T细胞的细胞间通讯分析

结果三、T细胞发育轨迹

Monocle2将T细胞分为7种分化状态，不同状态下CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的含量不同（A）。随伪时间变化，基因表达变化分为4组，分别与淋巴细胞介导的免疫、蛋白折叠、免疫球蛋白和细胞质翻译有关（B）。T细胞的marker基因的表达在不同分化时期发生动态改变（C）。

图 5 TNBC中T细胞的发育轨迹分析

结果四、T细胞的富集分析

作者进行了GO、KEGG和GSEA富集分析来阐明T细胞marker基因的生物学功能（）。GO富集分析生物过程（BP）主要与细胞质翻译、抗原处理和呈递、T细胞活化调控、肽酶活性调控和白细胞-细胞粘附有关；细胞成分（CC）主要与病灶粘附、基底细胞连接、细胞质核糖体、核糖体和核糖体亚基有关；分子功能（MF）与核糖体的结构成分、钙调素结合、MHC II类蛋白复合物结合、MHC蛋白复合物结合和未折叠蛋白结合有关。KEGG中marker基因主要富集在T细胞被激活发挥作用的通路中，包括Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化、细胞粘附分子、T细胞受体信号通路、肌动蛋白细胞骨架和PD-L1表达调控以及癌症中的PD-1检查点信号通路。GSEA结果则涉及T细胞受体信号通路。

图 6 T细胞marker基因的富集分析

结果五、预后模型构建和验证

将选定的1299个T细胞的marker基因插入到METABRIC数据集的TNBC矩阵中。然后对METABRIC队列中106个潜在预后基因进行单变量COX回归分析，再进行Lasso和多变量Cox回归分析（多变量Cox回归对Lasso分析的可靠性因素进行分析），OPTN、TMEM176A、PKM和HES1四个基因被鉴定为独立预后基因。独立预后基因将TNBC患者分为低风险和高风险两组，在训练队列（METABRIC）和验证队列（GSE58812）中，高危组中的患者预后较差。ROC曲线发现训练队列的AUC大于0.7，验证队列的AUC也大于0.65，表明四个预后基因能较好地预测TNBC患者的总体生存率（Overall survival，OS）（）。

图 7 T细胞预后风险模型构建和验证

结果六、TNBC与免疫细胞浸润和免疫检查点的相关性

由于bulk RNA-seq具有样本量大，临床信息多的优势，作者利用bulk数据进一步分析TNBC浸润免疫细胞的临床意义。作者使用CIBERSORT算法分析了METABRIC队列中肿瘤浸润免疫细胞亚群的比例，并建立了TNBC中22种免疫细胞图谱（A）。Estimate R包分别评估高风险组和低风险组患者的肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）。ImmuneScore、StromalScore或ESTIMATEScore得分越高，表明TME中免疫或基质成分越多。结果发现低风险组ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore较高，肿瘤纯度得分（TumorPurity）较低，表明低风险组TNBC患者的肿瘤比例较低（B）。T细胞CD8、幼稚T细胞、T细胞CD4记忆激活和T细胞γδ在低风险组中表达更高，而T细胞滤泡辅助细胞和调节性T细胞（Tregs）在高危组中表达更高。而且低风险组的静息树突状细胞和静息NK细胞与TNBC患者的不良生存预后有关（C）。高危组和低风险组免疫检查点差异分析表明，B2M、CD8A、CD40、CD40LG、ICOS、IFNG、IL23A和PTPRC在低风险组的表达量更高，且与TNBC患者的不良生存预后相关（D）。

图 8 T 细胞预后模型与CIBERSORT队列中免疫细胞浸润和免疫检查点的相关性

结论

总之，本研究基于scRNA-seq和bulk RNA-seq，重点探究了TNBC的T细胞表达谱和TME，并揭示了关键的潜在预后基因。本研究首先从功能富集、细胞分化轨迹和细胞间通讯等方面阐明了TNBC中T细胞的异质性。此外，构建的T细胞相关预后风险模型也被证明具有一定的独立预后价值。作者的工作不仅扩展了对TNBC相关T细胞的认识，还描述了TNBC的TME特征。scRNA-seq和大样本RNA-seq的联合分析将有助于推动TNBC精准免疫疗法的发展。不过，本研究的结果还需要进一步的实验和临床实践来验证。

总结

思路总结：

看到最后，我们发现作者的思路以及生物信息学分析手段都比较常规，有一定单细胞分析和bulk转录组分析的小伙伴都可以轻松复现这篇文章。当然，作者的设计也是环环相扣、层层递进，逻辑十分严谨。所以，这篇文章很值得大家收藏。小伙伴们，抓紧行动起来吧，下一个7+就是你的了！