今天给大家介绍的这篇文章于2019年12月12日发表于Cell主刊，题目为“A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart”，通讯作者Joakim Lundeberg现任瑞典皇家理工学院基因技术系主任，曾任SciLIfeLab（瑞典领先的测序中心之一）国家基因组学基础设施总监，在分子技术开发方面拥有丰富的经验，包括在基因组学和转录组学领域的应用生物信息学，以及在医学和环境方面的应用。这是他发表众多的测序研究中具有代表性的一件作品。接下来，让我们一起洞悉人体心脏发育的秘密吧！

人类心脏形态发生的过程还不完全清楚，其完整特征需要深入探索。在这篇研究中作者提出了一种分子方法，用于揭示在胚胎心脏的三个发育阶段细胞类型的综合转录图谱，并将细胞类型特异性基因表达映射到特定的解剖结构域，作者使用的样本和方法如下图所示：

作者通过免疫组织化学（IHC）染色分析受孕后4.5-5、6.5和9周（PCW）收集的人类胚胎心脏样本，发现左心室和右心室的自由壁和间隔以及左心房和右心房在所有时间点均由紧凑的小梁心室心肌组成；主动脉和肺动脉形成始于4.5-5 PCW心脏，在6.5和9 PCW心脏持续发展；仅在6.5和9 PCW阶段可见房室（AV）心外膜下间质，由此形成冠状动脉。

对所有三个阶段的联合空间（ST）基因表达谱进行降维和聚类，确定了10个时空上保守的簇，这些簇对应于所有三个心脏中定义的解剖区域；解剖区域之间的差异基因表达（DGE）分析表明了所有簇与肌肉收缩和发育相关的基因本体（GO）特征，而致密心肌（簇0）的代谢丰富；簇2表现出MB和NPPA的差异表达；心房心肌（簇4）也显示NPPA的差异表达；簇9显示心外膜标记物ALDH1A2、LRP2和ITLN1以及心外膜和心外膜衍生细胞（EPDC）标记物TBX18的表达；6.5和9 PCW的OFT簇（簇5）与成纤维细胞相关的细胞外基质基因表达丰富。

. 心脏三个发育阶段的全时空分析

作者比较了6.5 PCW两个样本的scRNA-seq和ST体基因表达的相似性，观察到强烈的相关性。对两个单细胞组分的基因表达谱进行了降维和聚类，并确定了15个细胞簇，能够识别已知的心肌细胞类型，从心肌细胞和成纤维细胞到平滑肌细胞和内皮细胞，检测到了三种类型的心肌细胞，心脏神经嵴细胞，雪旺祖细胞，心外膜细胞，内皮祖细胞，两种类型的内皮细胞和四种类型的成纤维细胞样细胞。

. 6.5–7 PCW人胚胎心脏的单细胞分析

作者将原位测序（ISS）的亚细胞空间分辨率应用于ST分析的三个心脏组织，设计了一个基因面板，利用来自两个匹配的6.5–7 PCW生物样本的ST和scRNA序列分析的信息。添加了先前报道的对心脏发育重要的基因，最终形成了69个基因的组合。随后在所有三个心脏上重复进行ISS实验，并观察到时间阶段内的高度相关性。最后使用单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）交叉验证了三个ISS基因探针的结果，证实其产生的模式与测序观察到的模式相似。

. 通过smFISH验证ISS数据

作者利用ISS和pciSeq方法，创建了在6.5-7 PCW胚胎人类心脏中确定的scRNA序列定义的细胞类型的综合概率空间细胞图；除了空间定位之外，细胞映射算法还利用scRNA-seq数据将读取分配给单个细胞；空间图包括20920个单细胞（即组织切片中细胞总数的76.2%），它们被成功地分配到scRNA-seq定义的细胞类型（不包括红细胞和免疫细胞）。

. 人类心脏发育中期的细胞类型图

ISS分析显示，在6.5–7 PCW心脏中，研究细胞类型的空间基因表达模式与ST和sRNA序列结果一致（免疫细胞和红细胞排除在分析之外），下图展示了这三种技术之间的一致性示例，ISS结果通过将scRNA-seq结果与相应空间标记基因的结果进行比较。在第14组中鉴定了两个细胞类型亚群：表达ISL1和STMN2的心脏神经嵴细胞和表达ALDH1A1的雪旺祖细胞；心脏神经嵴细胞仅在早期出现，而雪旺祖细胞仅在后期出现；心脏神经嵴细胞在任何时间点均不存在于房室结下心外膜间质中，但雪旺祖细胞在后期填充该区域；解剖由epdc（簇3）和成纤维细胞样细胞（簇2、4、5和8）组成的scRNA-seq簇群，作者发现epdc主要存在于心外膜下间质。

. 心脏发育三个阶段的靶向时空分析

最后，作者提供了一个公开的网络资源，以直观地探索调控人类心脏发育的空间基因表达模式。此资源包含ST和sRNA序列数据的浏览器、ISS信息的查看器和6.5 PCW胚胎心脏的3D查看器。建立3D模型的9个ST段组织切片可用于研究整体和单个空间基因表达模式，以研究心脏器官发生的一般和详细动力学。此外，从国际上数据得到的空间单元图与三维模型对齐，以提供单元分辨率。

. 三维基因表达图谱

本研究中，作者提出了一种创新的方法，它结合了三种不同技术（ST、scRNA-seq和ISS），以单细胞分辨率在器官水平上全面表征人类心脏形态发生过程中基因表达的时空差异。作者从四个人类胚胎心脏中获得了三个不同发育阶段（4.5-5、6.5-7和9 PCW）的转录快照，从而可以分析心脏结构形成的进展。作者的心脏发育模型是个具有单细胞空间分辨率的器官范围人类发育转录图谱。为了方便开发，作者还创建了一个公开的网络资源，可以用来研究和可视化二维和三维模型心脏发育过程中基因时空表达模式的研究。这些模型清楚地表明，空间和时间信息与单细胞基因表达数据的整合对于识别细胞类型之间的关键差异和详细分析发育中的组织至关重要。