m6A Regulator-Mediated Methylation Modification Patterns and Characteristics of Immunity in Blood Leukocytes of COVID-19 Patients

文章涉及基础概念简述：表观遗传学 (Epigenetics) 是与遗传学 (genetic) 相对应的概念。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如RNA修饰和染色质构象变化等。

背景1：RNA修饰是RNA分子化学成分的转录后改变，具有改变RNA功能的潜能。虽然RNA中已鉴定出100多个不同的变化碱基，但其中大多数局限于非编码RNA，特别是转移RNA和核糖体RNA。对于信息RNA，最普遍的内部修饰碱基是N6-甲基腺苷 (m6A)。m6A在调控mRNA表达的机制及其在多种细胞类型（免疫细胞）中的功能重要性已被广泛研究。

背景2：2020年5月，Ziv Shulman团队在Nature Immunology杂志上发表题为“The RNA modification N6-methyladenosine as a novel regulator of the immune system”的综述[1]。总结了m6A在调控免疫的各个方面的功能，包括免疫识别，先天性和适应性免疫反应的激活，以及细胞命运的决定。其中，“m6A调节抗病毒反应”与本文内容背景相关。抑制免疫反应的信号负责诱导快速和有效的抗病毒反应，同时抑制反应的规模和持续时间，以避免随之而来的毒性。因此，必须严格控制先天免疫识别激活的基因表达程序。事实上，m6A对参与抗病毒免疫反应的几个中心mRNA发挥了关键调控作用。有研究表明，病毒感染增强了RNA解旋酶DDX46与编码抗病毒蛋白MAVS、TRAF3和TRAF6的转录本的结合，导致ALKBH5的募集，从而去甲基化这些转录本。这种去甲基化反过来导致这些转录本保留在细胞核中，降低它们的蛋白水平，从而抑制I型IFN反应的产生。

正文解读：

文章于2021年9月投稿，2021年12月份发表于Frontiers in Immunology，历时3个月。研究人群为感染新冠病毒的126个患者，目的探讨血液中的白细胞m6A水平与感染新冠病毒后发生的变化，以及对患者预后的影响。下载GEO数据库中芯片数据（GSE157103），我们发现COVID-19患者血白细胞的m6a修饰水平明显高于非COVID-19患者，这种差异与CD4 + T细胞有关。通过无监督聚类鉴定出两个聚类，以T细胞活化为特征的m6a聚类A比m6a聚类b预后更高。代谢水平升高，免疫检查点阻塞，m6A簇b中m6A评分较低，根据9个筛选出的基因构建保护性模型，对COVID-19具有良好的预测价值。进一步分析发现，保护评分与HFD45、无呼吸机天数呈正相关，与SOFA评分、APACHE-II评分、crp呈负相关。我们的研究系统地描述了SARS-CoV-2感染患者中m6a甲基化修饰与宿主淋巴细胞之间的复杂相关性，并为预测患者的预后提供了一个良好的模型。

结果：

Upregulation of m6A Regulators and Activation of the Immune System in COVID-19 Patients

1.参与调节m6A的20个基因，在感染和未感染新冠病毒的患者之间存在差异表达（箱图）；2.按m6A甲基化专有分类：readers，writers，erasers将上述基因分类，进行相关性分析（相关性热图）；3.根据感染和未感染新冠病毒的患者的芯片测序数据，进行通路差异分析（GSVA），结果显示两组之间免疫相关通路激活状态不同，干扰素途径显著存在差异（热图）；4.免疫细胞浸润分析提示感染新冠和未感染新冠病毒患者之间血液的免疫细胞丰度存在差异，并且激活态的CD4记忆T细胞明显与readers存在相关性。

Patterns of m 6 A Regulators and Biological Function of Each Pattern

对感染新冠患者血液中的m6A的readers，writers，erasers基因进行富集分析：1.首先基于上述20个基因的表达矩阵，通过无监督聚类可以将新冠患者分为两个亚组；2.感染新冠患者亚组之间这20个基因表达存在差异；3.显著表达差异的m6A调节基因为CBLL1, HNRNPC, ZC3H13，IGF2BP1, METTL3, RBM15B；4.显著差异表达的m6A调节基因中METTL3为甲基转移酶复合体，提示亚组B的m6A甲基化水平更高；5.比较亚组A和亚组B之间，新冠患者预后相关的基因（既往文献报道）的表达差异情况；6.比较不同亚组之间的住院时间，提示亚组A住院时间更短；7.GSVA通路差异分析提示亚组A，B之间，代谢与免疫通路存在差异活化。

Immune Infiltration and Immune Checkpoint Characteristics in m6A Patterns

亚组A,B免疫浸润分析提示：1.亚组之间CD8和NK细胞丰度存在差异；2.经典的免疫检查点两组存在表达差异；3.根据免疫浸润评分发现亚组之间存在免疫状态差异；4.两组之间差异基因的富集分析提示感染新冠病毒的患者，不同的m6A水平影响患者血液中免疫细胞丰度的改变，以及潜在通过免疫检查点或代谢等通路影响患者预后。

Construction and Validation of an m6A-Related Protective Model

构建区分两亚组新冠患者的分子模型：1.亚组A,B的差异基因与新冠非新冠患者之间的差异基因取交集，得到4565个共同差异基因，通过lasso回归筛选出9个候选基因，构建预测模型；2.通过模型对本研究的患者进行打分，发现高低分组之间临床指标存在差异（赋予模型临床意义）；3.用来构建模型的基因的富集分析提示，这些基因参与了与细胞周期，病毒感染等生物过程。-6

总结

作者首先发现m6A甲基化调控的3类基因在感染和未感染新冠患者血液芯片测序数据的表达水平存在差异。免疫浸润分析发现新冠患者的血液中特殊亚群免疫细胞的丰度存在异常状态。GSVA分析发现患者与对照组的信号通路存在差异。通过无监督聚类将新冠患者分为两个亚群，亚群之间存在不同的免疫浸润、免疫状态和预后差异。最后，将患者与非患者的差异基因和亚群之间的差异基因取交集，构建预测模型，模型具有良好的诊断效能。

亮点点评

新冠无疑是今年研究热点，各大期刊也是优先发表的病种。要问生信如何发的快准狠，选择新冠作为研究的疾病不失为一剂良方；

基于m6A甲基化的免疫调节背景，恰好可以结合生信最具代表性的免疫浸润分析模块，不仅可以量化免疫细胞亚型的丰度，还可以利用免疫检查点、免疫细胞表型（M2极化，MDSC免疫抑制，Treg细胞免疫抑制）等热点问题丰富结果；3.本文的芯片数据，从临床信息的完整度来讲，质量要高于一般的肿瘤芯片数据，可能也是基于目前疫情的原因，大家极尽所能的想保留患者的临床信息。

于此，我们不妨再跳跃下思维，感染新冠的肿瘤患者的芯片数据是不是有很多，如果芯片数据存在，我们是不是又可以来一套新冠相关的肿瘤生信分析？通过这篇研究的结果，感染新冠后患者的免疫微环境发生变化，影响肿瘤患者的免疫微环境？进而影响患者的预后。除了m6A，铁死亡，焦亡，自噬，小众基因集（TP53基因集、趋化因子基因集、代谢基因集），是否也有不同的结果，又或者结合WGCNA等算法，碰撞不一样的火花呢？ 想发表新冠的生信文章，一定不要再拖了，打铁要趁热呀!

[1]. Shulman, Z. and N. Stern-Ginossar, The RNA modification N6-methyladenosine as a novel regulator of the immune system. Nature Immunology, 2020. 21(5): p. 501-512.