大家好呀！今天给大家介绍一篇发表在Clinical Cancer Research（IF:12.531）上的文章。PD-1免疫治疗联合白蛋白紫杉醇可用于治疗转移性三阴性乳腺癌（TNBC）。已有研究表明与单一化疗方法相比，化疗联合免疫治疗的效果更好。本研究作者分析83例乳腺癌在接受新辅助化疗前后的免疫相关基因的表达水平。研究TIME基因表达水平与RFS和OS的相关性。此外，作者使用scRNA-seq分析研究NAC的系统影响特征。结果表明，在非TNBC中，基因的表达水平与RFS和OS无关，而在TNBC中多个免疫相关基因与长期预后有关。乳腺癌患者的外周血中存在高细胞毒性T细胞特征与疾病复发和发展有关。本研究作者全面描述了NAC对TIME的影响，鉴定到TNBC对NAC的免疫作用十分敏感。免疫相关基因的表达水平增加与预后较好有关。外周血中细胞毒性基因的表达可能是疾病复发的一类生物标志物。

Changes in Peripheral and Local Tumor Immunity after Neoadjuvant Chemotherapy Reshape Clinical Outcomes in Patients with Breast Cancer

乳腺癌患者辅助化疗后周围和局部肿瘤免疫状态和临床结局重塑

结果：

1.RD中的sTILs可以改善对NAC不完全应答的TNBC患者的预后

本研究包括83例乳腺癌患者（44例TNBC），患者的相关信息如表1所示。由于sTILs可以作为乳腺癌患者的预后因子，作者首先进行KM分析。在接受NAC治疗后的TNBC患者中sTILs丰度较高的患者RFS和OS较好（A）。

2.NAC对TNBC患者免疫相关基因表达水平的抑制作用

作者对接受NAC后的患者的770个免疫相关基因的表达水平进行分析。基于这些基因的表达水平进行聚类，可分为不同的簇。其中大部分luminal/hormone 受体亚型的肿瘤为簇1，大部分HER2+亚型为簇2，大部分basal-like/TNBC亚型为簇3（B）。接受NAC前后免疫相关基因表达水平的差值如C所示，大部分TNBC患者中免疫基因的表达水平在接受NAC后降低。

3.NAC诱导的免疫相关基因表达使TNBC预后的预测因子

尽管sTIL中TIME的变化不能作为TNBC的预后因子，作者研究免疫相关基因是否与患者的结局有关。作者对接受NAC前后基因表达水平差异进行迭代Cox比例风险模型分析。有11个基因的上调表达与RFS较好有关，而有1个基因的上调表达与RFS较差有关。有大部分基因的上调与OS较好或OS较差有关（A）。KM分析表明，CDH1与RFS负相关而CD70与RFS正相关（B）。然而，在非TNBC患者中免疫相关基因的表达水平与RFS和OS没有相关性。

将这些基因表达水平分解为生物信息学分类的免疫标记。与RFS和OS较好的基因集如A所示，大部分与T细胞极化，T细胞免疫和T细胞激活有关。KM分析表明T细胞激活和NK细胞功能上调与RFS较好有关（B）。然而，非TNBC患者中没有基因集与RFS和OS有关。这些结果表明，NAC可以促进TNBC患者的免疫活性并改善患者的预后。

4.NAC诱导肿瘤和外周血T细胞克隆型和功能改变

作者对8个TNBC和7个非TNBC样本进行TCRβ链测序评估T细胞克隆的数量及接受NAC前后TIME中T细胞克隆的情况。结果表明，T细胞数量与sTIL相关性较强，而NAC没有改变T细胞克隆型。将乳腺癌按照亚型划分，NAC的克隆型也没有显著差异。TNBC在接受NAC后T细胞克隆型下降，非TNBC在接受NAC后T细胞克隆型升高。为进一步研究免疫治疗过程中T细胞克隆型和功能的变化，作者收集了4个乳腺癌患者的PBMCs（A）。在接受NAC的TNBC患者中poly-functional的PD-1HI CD8+ T细胞的比例增加（B），而ER+患者的PD-1HI CD8+细胞比例降低（B）。HR+HER2+的患者在接受NAC后T细胞功能几乎完全丧失。TNBC患者中PD-1HI CD8+细胞产生的细胞因子主要为效应因子和趋化细胞因子（C）。使用TCR测序分析接受NAC前后的PD-1HI CD8+和PD-1NEG CD8+ T细胞。尽管所有样本中T细胞数量一致，但是在PD-1HI CD8+ T细胞中的克隆型比例较低（D）。这表明PD-1 HI中的重复序列较多，为克隆扩增。与PD-1 NEG CD8+ T相比PD-1 HI中发生克隆型扩增的比例较高（E）。

5.外周血PD-1HI CD8+ T细胞的scRNA-seq分析鉴定独特的细胞溶解效应细胞

接下来，作者对2例接受NAC后的TNBC患者手术室的外周血PD-1HI CD8+ T细胞进行scRNAseq，1例患者为Pt.1另一例患者为Pt.4。UMAP将细胞分为5个cluster（A和5B）。C为每个cluster排名前10的差异表达基因。尽管细胞组成比较类似，但是cluster0富集于Pt.4中。cluster0中的大量的MHC-I，MHC-II家族成员，细胞溶解因子和免疫检查点基因高表达（C和5D）。分析关键细胞溶解因子和杀伤鉴定基因的表达模式表明这些基因几乎仅在cluster0中表达。为了深入了解cluster0中的基因，作者对2例接受NAC后的TNBC患者的PBMCs进行scRNA-seq（Pt.4和Pt.5）。使用UMAP降维和SingleR进行细胞类型注释（E）。有7个基因富集于cluster0中（PDCD1,NKG7,LAG3,GZMH,GZMB,GNLY,FGFBP2），有1个基因富集与PT.4，对这8个基因进行进一步分析。这8个基因在CD8+ T细胞中的表达水平最高（F）。

6.血液中存在细胞溶解基因特征且与复发率增加有关

为研究cluster0代表基因细胞溶解特征是否与疾病结果有关，作者对58例患者的全血进行分析，其中包括34例接受NAC的患者和24例未进行治疗的患者样本（表2）。选择cluster0中富集的8个基因，Pt.4中富集的1个基因和3个标准化对照基因进行NanoString基因表达分析。有几个基因在早期疾病复发的RD患者和接受NAC后的pCR患者中的表达水平具有显著差异（A）。PDCA1+NKG7+LAG3+GZMH+GZMB+GNLY+FGFBP2-HLA-G的综合打分同样与疾病的进展显著相关（B）。然而这些基因的表达模式具有一定异质性和独立性（C）。

结果：

本研究作者对83例乳腺癌患者的TIME进行分析，研究接受NAC的TNBC患者肿瘤免疫相关基因与预后和治疗结果的相关性。在免疫相关基因中细胞毒性效应细胞相关基因与治疗结果显著相关。此外，作者鉴定到接受NAC的TNBC患者的外周血中PD-1HI CD8+ T细胞的细胞溶解因子显著增加。TCR克隆型分析表明化疗可能会增加肿瘤中T细胞克隆。对手术后的TNBC患者的外周血进行单细胞测序鉴定到细胞溶解效应T细胞及其高表达基因。然而，本研究还存在一定局限性，例如本研究的scRNAseq的样本量较小。本研究为更好的理解化疗改变TIME和抗肿瘤免疫提供了新的信息，可以更好的了解可能受益于化疗的患者。