溃疡性结肠炎和克罗恩病具有令人困惑的异质性。近日自然通讯的论文，通过单细胞转录组结合空间分子影像，揭示了患者之间最大的差异存在于包括巨噬细胞和嗜中性粒细胞在内的骨髓间隔内，通过将单细胞 RNA 测序鉴定的每个巨噬细胞和嗜中性粒细胞亚群进行空间定位，基于其组织定位可进一步揭示巨噬细胞多样性。这些数据指出骨髓和基质间隔可成为了解患者对患者异质性的重要细胞亚群，从而为进一步的临床研究提供方向。

该文将展示本项研究的四个核心发现，并突出该研究是如何结合多组学数据，从而得到有生物学意义的结论。

论文地址：https://www.nature.com/articles/s41467-023-40156-6#Abs1

论文标题：Macrophage and neutrophil heterogeneity at single-cell spatial resolution in human inflammatory bowel disease

1 组间存在细胞比例差异

巨噬细胞以其组织可塑性而闻名。然而，肠巨噬细胞的起源，表型和功能仍然是一个争论的话题。针对IBD患者，活化的亚群已被描述为具有促炎功能。

该研究选取6位健康人与6位溃疡性结肠炎和6位克罗恩病患者，通过对结肠样本的单细胞及CosMx 空间转录组测序（a）。通过单细胞测序，共鉴定79个不同的细胞聚簇(b)，，通过差异表达基因(DEGs)分析，可检测出具有簇特异性的标记基因。这些差异基因被用来注释亚群。b的右边，UMAP 显示了由 scRNA-seq 鉴定的所有细胞类型的降维结果。c与d分别展示了基于单细胞和空间转录测序得到的2个疾病组与对照组中，不同类型的细胞所占比例，可观察到不同细胞的比例在疾病组与对照组之间存在显著差异。

概述基于单细胞和空间影像的实验设计和结果

2 骨髓内细胞聚簇的比例差异最大

找到了组间差异，接下来要做的是结合空间转录组，分析那些组织的样本，细胞比例差异最大，从而将其作为进一步机制研究的重点，或作为临床诊断的依据。值得注意的是，当比较患者组不同组织的聚类比例时，发现在骨骼内患有 IBD 的个体之间，存在最显著的差异，其次是基质隔室。a展示了对照组和溃疡性结肠炎组在骨髓中的单细胞聚类，以及细胞类型占比情况。通过基于 k 最近邻图的工具Milo，可确认两组间的细胞丰度存在显著差异。c找出差异基因，其中红色代表上调基因，而绿色为下调的基因。通过差异基因，可以找到M2巨噬细胞的特异性标志物(即基因 CD163L1，CD209，FOLR2)，同时，可将 对照组中存在的另外两个簇注释为 M0(M0和 M0 _ ribhi) ，这些巨噬细胞的表达谱缺乏 M2特异性标记基因，但高度表达所有其他巨噬细胞的特异性基因。

而通过d展示的三组在差异基因上表达量的热图，也可确认不同组之间存在显著差异。f的空间转录结合影像，显示两名对照组，一名克罗恩病和两名溃疡性肠炎患者的结肠组织的代表性视野中不同骨髓细胞群的空间分布。白色圆点表示溃疡区域有丰富的 M1巨噬细胞，g显示了结肠组织中，包括上皮细胞、基质细胞、 T 细胞、 B 细胞和浆细胞以及骨髓细胞和 M0和 M2巨噬细胞(下图)的细胞定位，在健康结肠中，常驻巨噬细胞最接近粘膜表面，而肥大细胞和树突状细胞则倾向于定位于更深的粘膜层。在发炎样本中，M1巨噬细胞和中性粒细胞最接近粘膜表面(溃疡区) ，骨髓间隔的重塑是明显的。f通过免疫荧光验证了e展示的差异。概况这一节的发现，即病患组中存在特异性的巨噬细胞，可通过标志基因鉴定。

健康与发炎的结肠组织中，骨髓细胞的差异表达与空间位置差异分析

3 炎症相关(IDA)巨噬细胞与炎性成纤维细胞共同出现

找出与疾病相关的免疫细胞（散布在发炎结肠中的大量 IDA 巨噬细胞，代表了最广泛的炎症依赖性巨噬细胞状态）之后，研究者通过空间转录组，发现炎症相关(IDA)巨噬细胞与炎性成纤维细胞共同出现。a分别列出溃疡性肠炎与克罗恩病患者组中，不同类型的细胞与炎症相关(IDA)巨噬细胞的空间相关性，可以看到炎性成纤维细胞的相关性显著为正。b展示了基于空间转录组代表性的6个病患样本中，IDA与炎性成纤维细胞共同出现的情况。c展示代表性的影像得到的共定位结果，通过放大框出区域，可以确认在炎症结肠组织中，IDA与炎性成纤维细胞共同出现。炎性成纤维细胞强调它们与巨噬细胞的相互作用，表达促进巨噬细胞活化的 CSF2(GM-CSF) ，而活化的巨噬细胞可以产生可以驱动成纤维细胞活化的介质。

在IDA共同出现的炎性成纤维细胞，同样可通过单细胞测序鉴定其标志基因，炎性成纤维细胞分别表达编码 GM-CSF 和 G-CSF 的 CSF2和 CSF3，以及产生前列腺素的酶 PTgS1，PTGES，PTgS2（f展示炎性成纤维细胞，IDA 巨噬细胞，M2和 M1中前列腺素相关基因的表达量）。d展示炎性成纤维细胞标志基因在3组中的表达量（小提琴图），e通过bulk转录组验证了上述标志基因的差异确实存在。

炎症相关(IDA)巨噬细胞与炎性成纤维细胞共出现示意图

4 溃疡性肠炎患者间存在显著的组内异质性

研究还发现，包括嗜中性粒细胞在内的粒细胞与IBD巨噬细胞，同样在病患组中显著增加，通过聚类，可以将嗜中性粒细胞分为三个亚群，且在患者间，不同亚群的比例存在差异（a），这揭示了组内异质性。通过b的小提琴图可视化所有三个中性粒细胞群体共同和特异的基因的表达量表达量，可以看出大多数表达量存在多个峰，这进一步说明了异质性的存在。c展示了所有三个中性粒细胞亚群中差异表达基因，经过平均归一化后的表达量热图。这些基因在来自脐带血和骨髓成熟嗜中性粒细胞的嗜中性粒细胞上的平均表达量显示在最右侧。从该图同样可以看出显著的组内异质性。d展示具有代表性的，来自4个IBD患者发炎组织中N1，N2和 N3中性粒细胞亚群的空间位置，也可以看出期间存在显著差异。

炎症性肠病结肠粘膜中性粒细胞群的异质性分析。

5） 总结

该研究的价值，在于提供了关于炎症性肠病的数据集，通过单细胞结合空间组学与影像的分析，不仅找出了差异的细菌聚簇，还定位了细胞聚簇出现的区域（骨髓），感知微环境变化的肠巨噬细胞可以作为患者特异性分子模式的可靠指标，因此，有希望成为靶点。通过共定位分析，可以找到与疾病相关巨噬细胞共同出现的成纤维细胞与中性粒细胞，从而提供关键的生态位信息。该研究通过组内的亚群比例，揭示患者间的异质性，从而解释了不同病患治疗效果的差异，并指出IBD固有的复杂性。