只需要一管血，就可以进行多种癌症的早筛，这究竟是媒体的宣传，还是即将到来的现实？目前多癌种早筛（又称“液体活检”），已有多条技术路线，例如基于游离DNA片段，也可以基于甲基化特征，或白细胞中的单碱基突变。为了系统性地评估不同策略在癌症早筛上的准确性，循环细胞游离基因组图谱(Circulating Cell-free Genome Atlas,CCGA)于12月12日的Cell子刊“Cancer Cell”登出论文“Evaluation of cell-free DNA approaches for multi-cancer early detection“，指出基于甲基化的多种癌症早筛，是目前最有前景的方法。该研究是首个针对多种癌症早筛（multi-cancer early detection）方法的系统性评估。

论文地址：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S153561082200513X

1）研究难点和方法学设计

为评价癌症早筛方法，需要一个包含足够样本量的数据集，其中包含了一段时间后患癌的人，以及与其有相近的人种及流行病学特征（例如吸烟比例，BMI等）的对照人群。之后使用高深度全基因组测序，游离DNA测序，或全基因组甲基化测序，分别进行检测，使用同一组参与者评估不同的检测方法。还需要通过样本随机化，以避免批次效应。

在该评价研究中，共招募2800名被试，其中1628名事后被发现患有癌症，剩下的1172人为健康人，2800被试中2261人的数据满足分析要求，之后将其分为1414用于模型训练，847人用于验证模型准确性。具体情况见。

：研究中被试的分组情况

被检验的预测模型共有10个，其中9个使用了cfDNA测序数据中提取的特征，另一个模型只基于临床数据。检测方法包括30x深度的游离dna甲基化测序，对507个基因的芯片高深度测序（去重后测序深度3000x以上），30x的游离dna及白细胞全基因组测序。考察的特征包括全基因组甲基化情况，体细胞snp及indel。游离dna片段长度，片段终止点，碱基平衡状况及年龄，吸烟史等流行病学指标。

表1：模型实验的测序方法

2，基于甲基化的模型表现最佳

在所有模型中，表现最好的是基于全基因组甲基化测序的模型，其敏感性为98%，特异性为39%（训练集），34%（测试集），其后依次是基于白细胞和配对游离dna测序，得到全基因组新发snv的模型；基于经过背景消除后从游离dna测序得到是snv的模型，以及混合特征（pan-feature）模型。具体每种方法的表现见表2

表二：在9种方法达到98%特异性时，在测试及验证数据集上的敏感性。其中SCNA为新发拷贝数变异，WBC为白细胞

展示了各种模型的ROC曲线（越高越好），左图为训练阶段，右图为验证阶段。可以看到训练阶段表现最好的是基于甲基化的模型，而验证阶段，混合特征模型的表现最好。

：不同分类模型用于癌症特征检测时的ROC曲线

针对表现最好的三种模型：全基因甲基化，游离dna全基因组测序及游离dna与白细胞配对检测，分别考察在针对10种癌症早筛时的表现情况，见。可见癌症早筛的方法，大多数情况下不会出现检出的癌症种类混淆。

：三种表现最好的方法，针对不同种癌症检出时的混淆矩阵，颜色越深，说明对应的癌症种类中被正确预测的比例越高

所有癌症早筛检测方法，存在一个检测下线，称为limit of detection (LOD)。当游离dna中包含的肿瘤特异性变异低于该下线后，该方法无法区分信号与噪音，故而无法检出该类突变。为了确定不同模型临床上的检测下线，该研究的作者将一种预测模型，能够以98%以上的敏感度，且以至少50%的概率检出某种癌症标志物时，输入该模型的数据中癌组织特异变异的比例作为该模型的临床检出下线。该下线越低，说明对应的早筛方法能够为检测者提供更长的预警时间，而不是等癌症发展到中期或晚期才能检出。

列出了不同方法的临床检出下线，可以看到基于特定区域富集后甲基化的方法，临床检出下线最低，其次是全基因组甲基化及基于混合特征的模型。而基于snv及游离dna片段终止位置的方法，需要肿瘤对应的变异频率达到2%之后，才可以准确地检出癌症信号。

：基于不同特征的分类模型的临床检测下线箱线图

随着肿瘤阶段的增加，癌组织脱落物的比例也会增加，故所有模型的检出概率都会随着患者癌症所处阶段的增加而增加。列出了对于不同阶段的癌症，其血液中游离DNA中的癌症变异的比例，结合，可以看到除了基于甲基化的方法，可以在癌症一期或二期检出外，其余最低检出概率在0.005以上的方法，都只能检出三期及四期的癌症患者。

：不同阶段的乳腺癌，结直肠癌，肺癌和其它癌症游离dna中肿瘤特异性变异的比例

3）总结

该研究是首个多中心系统性评估基于游离dna进行多种癌症早筛方法的研究，其研究设计包括平衡的人口统计学、临床分期和癌症类型，可作为当前主流的各种癌症早筛方法准确性的基准。该研究同时还提出了”临床检测下线“的指标，通过该指标可判定不同早筛方法能够提供多少提供多久到预警时间，临床检出下线越低，就越有可能在癌症早期进行早筛。

在目前的早筛方法中，检测的准确性最高的是基于甲基化的方法，其中对特定区域富集的方法，临床检出下线更低。这是由于甲基化情况是一个遍布整个基因组的信号，此外，每个片段的甲基化模式包含一个显著的肿瘤特异性信号，可以很容易地识别上述正常的基因组背景变异，这可能使甲基化信号检测的游离肿瘤dna水平低于其它方法。该研究还指出，更具侵略性的癌症往往会脱落更多的 特异性DNA 进入血液，cfDNA检出的癌症信号和与更具侵袭性的肿瘤相关具有生物学合理性; 因此，cfDNA 分析可能需优先检测临床显著的癌症。