Hi, guys~ 好久不见呀！今天小编跟大家分享的是Molecular Cancer上的一篇单细胞文章，该杂志的IF已经41+了啊！！！让我们看看，在单细胞文章数量呈井喷式增长的当下，该研究是怎么仅凭四个样本以及简单的分析冲出重围的呢？话不多说，咱们看正文吧。

研究流程

本研究选择的癌型是伴有破骨细胞样巨细胞的胰腺未分化癌(UCOGCP)，这是胰腺导管腺癌（PDAC）的一种罕见亚型。作者收集了一名UCOGCP患者（pca_ai1）和三名PDAC患者（pca_0708, pca_0713,pca_0714）的手术标本，经过组织解离、细胞纯化、文库构建等，对18,376个细胞进行了单细胞测序，然后对得到的scRNA‑seq数据进行预处理。接下来，就是常规的生信分析，包括细胞的聚类分析、可视化和注释，轨迹拟时序分析，细胞通讯分析，功能富集，调控网络分析，以及其他数据集和免疫组化的验证（.A）。

研究结果

1、细胞聚类和注释

在0.6的分辨率下，作者识别出了19个具有不同基因表达模式的细胞簇（.D-E）。同三个PDAC样本相比，UCOGC样本中内皮细胞，成纤维细胞和髓系细胞占比更高。考虑到破骨细胞样巨细胞（OGCs）可能起源于间质上皮细胞，作者又分析了在cluster 13和cluster 15（I型导管细胞的两个簇）中，间质上皮细胞的标志物EPCAM和KRT19以及OGC的标志物CD68的表达水平，发现cluster 15除表达KRT19外，还表达KRT81、PAEP 和 LINC01615，但不表达EPCAM（.I）。对KRT81的免疫组化也证实了cluster 15含有OGC，表明 OGC 很可能起源于间充质上皮细胞而不是髓系细胞(.J)。

2、UCOGCP 中I 型导管细胞的异质性

研究将I型导管细胞簇进一步分成了四个subclusters（.A-B），同其他样本相比，UCOGCP富集上皮亚型subcluster 2、3（.C-E）。其中，subcluster 3表达有限的上皮标志基因EPCAM，但却表达癌症干细胞标记基因CD44和NOTCH2，并显著富集“MYC-TARGET_V1”通路，以及“细胞外基质组织”、“创伤反应”、“多细胞生物发育”、“白细胞黏附”等GO通路（.F-G，J）。基于TCGA-PAAD数据集的验证表明，这些通路的特征基因的高表达多与较差的生存相关。

基于此，作者又把subcluster 3重聚类为五个亚型（.A-B），cluster 4和cluster 1表达癌症干细胞样细胞（CSCLCs）的标记基因CD24, CD44和EPCAM，cluster 0和cluster 2 表达CD44 和 NOTCH2（.C）。Cluster 0与上文中疑似OGC的cluster 15具有高度的重合（.D），该亚型富集到了抗原呈递、造血干细胞分化和G2/M负向调控等通路（.E），轨迹分析和不同模块的GO富集结果表明该簇可能是CSCLCs失调产生的多核细胞。

3、UCOGCP中导管细胞的轨迹分析

为了进一步分析UCOGCP中上皮细胞簇的发育过程，研究将前面提到的cluster 13和cluster 15重新分成9个clusters（.A-B），并进行了轨迹分析。在得到的三个分支中，cluster 13和cluster 15属于不同的分支（.C-D）。不同状态中高表达的基因富集的功能通路也存在差异（.E），在决定细胞命运走向时，起关键作用的基因有APOE, MUC13, NEAT1, SERPINE1, SRGN和TIM1（.F）。此外，根据转录组热图可以发现E2F1、MYC、EGR4等转录因子在缺乏EPCAM的上皮细胞簇，即分支1中高度表达（.G）。

4、UCOGCP中TAM细胞的异质性

在最初的聚类中，研究发现UCOGCP中存在大量的肿瘤相关髓系(TAM)细胞。所以，作者将四个样本中的TAM细胞又划分为五个簇（.A-C）。UCOGCP中的髓系细胞主要分布在cluster 2和cluster 3（.D-E），在验证集中，这两个簇的特征基因与OS相关（.G）。通路富集分析的结果也表明了这些簇在代谢途径上的不同（.F）。

5、肿瘤相关成纤维细胞和内皮细胞的异质性

接下来，作者分析了所有样本中的成纤维细胞，共得到四个簇，都高表达成纤维细胞的标志基因ACAT2（.A-D）。其中cluster 3来自UCOGCP样本，与白细胞粘和MHCII 抗原呈递相关（.H）。

然后，作者又将肿瘤相关内皮细胞分为六个簇，它们高表达标志基因PECAM1（.A-C）。其中，86%的内皮细胞来自UCOGCP样本（主要分布在cluster 3和cluster 5），与UCOGCP是容易出血的肿瘤这一事实一致（.D-E）。GSVA 分析表明每个簇富集到了不同的KEGG通路（.F）。

6、细胞通讯

基于之前的细胞聚类和功能注释，作者将UCOGCP中的细胞分成了22个簇（.A-B）。通过分析破骨细胞标志基因的表达水平，研究发现OGCs可能只是在形态上类似于破骨细胞，并不表达CD68（.C）。细胞通讯分析的结果揭示了OGC和PSC、巨噬细胞_I/III、某些上皮细胞和内皮细胞之间的强受体-配体相互作用（.D）。其中，SPP1-CD44、CD74-MIF、CD74-COPD和CD74-APP等受体-配体对表现出强相互作用（.E-F），这些特征基因的表达水平与预后显著相关。

整个研究内容大体就是这样，虽然是很经典的单细胞分析流程，图片也没有很惊艳，但文章胜在选题，小编发现PUBMED中UCOGCP相关的文章寥寥无几，单细胞相关的就更是相当于没有了，加上作者重点突出、层层递进，该有的都有，故事讲的算是完整，而且人家用的是自测数据，再来那么一丢丢运气，这不就直接冲到40多分了！加油呀，各位打工人！Have a nice day~~~

参考文献：Wang, X., Miao, J., Wang, S. et al. Single-cell RNA-seq reveals the genesis and heterogeneity of tumor microenvironment in pancreatic undifferentiated carcinoma with osteoclast-like giant-cells. Mol Cancer 21, 133 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01596-8