导读：了解不同组织在空间结构上的细胞异质性和发育动态，对生命科学意义深远。空间转录组技术，使得研究者可以生成并验证假设，并和其它类型的数据结合。8月Nature的综述，先讲了评估不同空间转录组技术的6个指标，3种技术路线。之后分别在发育，疾病和生理上，论述空间组的应用。之后重点谈论在探索性的数据分析中，5个不同的分析目标策略和3种策略。最后探讨了如何将空间组数据和其它类型的数据整合。

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03634-9

1）空间组技术概述及应用方向

从技术路线上，空间组测序分为基于二代测序，通过加ployT和代表空间信息的接头的方法，以及原位测序，原位杂交之后，分别比对，从而得到各个方格的基因表达量矩阵三种方法。

三种空间转录组的实验策略

评价不同技术有六个指标，依次是通量（一次能检测的基因数）测序信息（是否能检测全长转录本，从而检测基因融合，剪切同构体及单碱基突变）敏感性（相同大小的方格内，能够检测到的基因数，例如基于NGS的技术，其敏感度就不如原位测序），分辨率（每个方格的大小，光学成像的方法，有对应的最小分辨率极限），切片大小（每张切片的面积越大，能够考察的组织越大），可行性（技术能否被广泛地使用）。

基于NGS的方法，目前是发展最快的，潜力最大的。其在单细胞测序的基础上研发，其主要代表是10X，其中每个区域有对应的barcode，通过比对得到该序列的来源。其当前的分辨率在55um，每个方格可以检出上万个基因，切片面积在10平方毫米，而新推出的Stereo-seq，其分辨率在纳米级。而另外两种基于影像的方法，在得出表达量矩阵后，需要手动或用算法分出细胞边界。

在发育上，不同时间的空间转录数据，可以阐明各组织的正常情况的发育地图和动态，指出每个阶段，不同相对位置的关键基因；对于患病组织，可以找出治病基因出现的时间和空间顺序；指出癌变组织和正常组织间的边界；对于神经退行疾病，炎症和感染等生理过程，空间转录也可以指出其发生过程中何时何处哪些关键基因发生了变化。

2）空间转录组的分析套路

空间转录组的生信分析，起点是不同位置的各基因的表达矩阵，其第一步是去除低质量的数据，提高信噪比，常用的方法包含Giotto，Seurat，STutility等包，对数据质量的评估，包括检测到的基因总数，以及每个区域检测出的平均基因数。由于临近的区域内基因表达量相近，可以通过滑动窗口，来提升每个区域检测的基因数（灵敏度)，通过除以转录本总量，或负二项回归的方法进行标准化，再通过数据缩放，使得每个方格的平均值和方差相等。

归一化的基因表达矩阵，是接下来各类探索性分析的统一输入（下图中间的部分），由于空间转录数据的高维度，在分析前，难以预设计划，需要根据分析的结果，调整下一步的分析计划，因此这样的分析是探索性的。

五种探索性分析的套路

聚类是识别成一组具有相似转录组的点在空间上的聚集情况。通过聚类（例如UMAP，tsne或针对空间数据开发的聚类算法，如BayesSpace），可以识别共表达的区域，以及与细胞类型或细胞状态相对应的基因模块。

识别高度可变的基因，通常是可以根据它们在组织中的分布情况，对其空间自相关情况进行评分，例如SpatialDE ，利用高斯过程回归，可将给定基因的表达变异性分解为空间变异性和非空间分量。

由于基因是共同表达的，通过打分函数，可以将一组表达量相似基因，作为一个单基因表达谱，从而以这种方式，相比单基因的分析方法，更好地总结组织在空间上的功能特性，最简单的可通过对集合内的基因取平均值，或者结合单细胞数据，进行打分。

要想解释空间组发现的数据，需要和单细胞或其它来源的先验知识进行整合，这就需要根据转录信息，对于不具备单细胞分辨率的方法，这意味着预估各个方格内的细胞类型及分布。而对于亚细胞级的方法，难点在于将细胞圈出，并确定不同细胞器对应的方格。

关联：空间转录组学是非常适合鉴定基因和组织区域的转录的相似性、差异性，不同区域间的空间重叠，或者发育或者功能上的相关性。当标注细胞后，还可以检出受体和配体之间的信号传递和相互作用。

假设驱动的空间组研究范例

在实验设计上，空间组即可以用来健康组织，期望能揭示意想不到的变化和描述新的假设，如所示，也可以去传统的假设驱动行，用以验证假设，如所示。例如通过聚类识别协同变异基因，并根据它们的所在细胞的特征，找出受体和配体对的高表达子集用于分析细胞间的通信；通过聚类，之后对同类基因打分后，得到不同区域的得分，说明不同区域的基因表达存在差异；或者找出不同区域的细胞类型的差异。

探索性的空间组研究全流程

以上两种分析，其各自对应完整的实验设计，如上图所示。对于探索性的研究，通过不同位置，不同时间的切片（发育），或者受到药物，基因编辑或感染影响前后的组织。通过生信分析，找出差异基因，之后通过染色或原位杂交进行验证。

假设验证型的空间组研究全流程

另一类假设验证型，需要收集多份时间组和对照组在相近条件下的组织切片，测序后找出统计显著的差异，之后的验证可以通过临床数据，体外或体内干预的方式进行。

3）未来技术前景的展望

随着空间转录技术的分辨率和灵敏度的提高，通过高分辨率影像数据的融合，可以进一步提升分辨率。在亚细胞分辨率，染色质的空间组织可能提供了在不同情况下，其是如何调节基因表达的线索。而结合深度学习，可提升组织病理学切片的可解释性，增强其在临床决策中的应用。

另一个方向，是集成原位基因组和原位组蛋白标记的空间分布数据。通过对特定位置的细胞进行全基因组测序，并检测其蛋白质组成，可以加深我们对基因组组织和功能，以及翻译后蛋白质修饰及其在疾病中发挥功能的了解。

每个细胞都和其相邻的细胞最相似，但多细胞却能产生复杂多变的时空模式。随着技术进步，系统地分析更大的组织区域成为可能，可用于重建3D 器官或生物体层面的细胞表达谱，并可视化转录组的变化，最终解决多细胞空间模式是如何从细胞水平的特性中涌现出来的这一问题。