骨关节炎（OA）是一种非常普遍的，与年龄相关的关节疾病，其特征在于软骨退化，活动性丧失和慢性疼痛。OA的病因非常复杂。然而，直至今天也没有用于治疗OA的药物，在单细胞水平上理解该组织可以发现更深层次的病因和病理进展。

OA软骨富含软骨祖细胞（CPCs），虽然CPCs具有迁移、形成高度克隆种群和多向分化潜能，但在健康和患病状态下，整体软骨修复仍然很低。即使在经历软骨相关损伤的年轻非OA患者中，软骨修复效率也是非常地低。总的来说，这表明存在阻碍组织有效修复和再生的因素，并且这些因素因患者而异。

这种有限修复的一个原因可能是关节的慢性炎症。为了理解这种环境如何影响CPCs等增殖性细胞群，斯坦福大学医学院骨科Nidhi Bhutani教授带领团队使用单细胞测序来绘制增殖性细胞群和炎症性细胞群。该研究成果以“Single-cell Mass Cytometry Reveals Cross-Talk Between Inflammation-Dampening and Inflammation-Amplifying Cells in Osteoarthritic Cartilage”为题，发表在《Science Advances》杂志上。

通过同时能够映射细胞身份和信号状态，该研究团队可以观察细胞如何相互作用和相互影响。此外，这些单细胞图谱为该研究团队提供了基于细胞群的OA患者分层，这可能有助于将来进行有针对性的OA治疗。

正常（蓝色）和OA（红色）软骨细胞的tSNE投影，其中每个细胞由点表示。每组随机下采样至9000个单元（，B）。OA和正常细胞的空间分布不同（，C和D）。所有细胞都高表达SOX9和CD44，确保了细胞的软骨形成表型，在样品处理过程中没有观察到去分化（，E和F）。OA的特征性图谱显示NOTCH1的软骨细胞在扩增（，E和F）。相反，磷酸化的NF-κB（pNF-κB）不能轻易区分正常和OA样品，这两个样品均由表现出高、中、低水平信号传导的亚群组成（，E和F）。

.使用质量流式细胞术（CyTOF）对正常和OA软骨细胞进行高维分析

FlowSOM算法确定了20个亚群（，A和B）。亚群的所有表面受体和细胞内标志物的标准标度分布矩阵（C）证明了这些亚群的分子特征。将这些亚群广泛定义为软骨祖细胞（CPCs）亚群或非CPCs亚群（D）。该研究团队研究了在正常和OA样本中所识别的亚群的性质和频率是如何变化的，特别是确定亚群是因疾病而获得还是消失。该研究团队将这些亚群分为三组：（1）在OA组增加，（2）不变，（3）在OA组减少（D）。

对亚群频率的量化揭示了患者间的异质性，该研究团队用变异系数对其进行了量化（E）。CPCs亚群4和16以及非CPCs亚群19是OA患者之间变化最大的，而亚群15和20是变化最小的（E）。作为量化这种异质性的另一种方法，该研究团队使用了种群生态学中使用的一种度量方法，即Shannon多样性指数，它描述了生态系统中种群的异质性和均匀性。在FlowSOM鉴定的20个群体的基础上，该研究团队观察到OA样本具有较高的Shannon多样性指数，另外OA患者的H值范围大于正常样本，表明OA中亚群数量均匀性的丧失（F）。

所有正常样品聚集在一起（G）。该研究团队观察到三大类患者，其中一些患者仅与自己聚集。A组是12名患者的三组中最大的一组，富含亚群7和11，以CD105表达为标志（，G和H）。B组由3名患者组成，在17和18组、CD24+亚群中富集，C组也由3名患者组成，富集亚群9、12和16，被确定为NOTCH1/VCAM-1（血管细胞粘附分子-1）阳性CPCs（，G和H）。

.正常和OA软骨图谱由丰富和罕见的亚群组成

为了更好地表征CPCs，该研究团队制定了13个cyTOF标志物组（A）。在使用FlowSOM鉴定的20个亚群中，发现12个亚群以各种组合富集这些CPCs标志物（A）。与之前的观察结果相反，该研究团队发现有三种CPCs亚群在OA中减少（B），该研究团队称之为CPCs I,其余的两个亚群在正常和OA软骨之间没有变化，称为CPCs II，六个亚群富含OA软骨，该研究团队称之为CPCs III（B）。与CPCs III亚群相比，CPCs I亚群的特征在于低表达CD105（A）。细胞周期分析显示CPCs I亚群具有最高百分比的循环细胞（C）。CPCs I亚群仅以细胞外信号调节激酶1/2信号传导为特征，而除CPCs II亚群10外，其他亚群则没有（D）。在CPCs II亚群中，亚群4高表达CD73（D）。亚群12,13和16在pNF-κB，pSTAT3（磷酸化信号转导和转录激活因子3），β-连环蛋白和HIF2A的表达中高，与OA中的炎症相关。然而，CPCs III在这些途径中也有较低的亚群，即第7,9和11亚群（D）。

.OA患者在CPCs类型中有差异性富集

进一步分析非CPCs亚群的炎症群体，亚群15和20，共表达IL1R1（CD121A）和TNFRII（CD120B）（，A至C）。与正常软骨相比，亚群20在OA软骨中显著扩增（D）。亚群20具有高表达IL1R1（E）。该研究团队成功鉴定在scRNA测序数据中表达IL1R1和TNFRSF1B转录物的细胞。这些细胞约占测序细胞的2%，验证了该研究团队通过cyTOF观察到的数量。表达IL1RI/TNFRII的软骨细胞高度富集与先天性和适应性免疫细胞，炎症以及关节炎中改变的T和B细胞信号传导相关的途径（F）。因此，该研究团队称为亚群15和20为炎症放大（Inf-A）软骨细胞。

与其他软骨细胞亚群相比，Inf-A亚群显示通过pJNK和pSMAD1/5的独特信号传导（，G和I）。相反，亚群15和亚群20中的pNF-κB水平与鉴定的其他亚群相似。

将该研究团队的分析仅限于在5名或更多患者中改变的那些细胞因子（>83%响应率），该研究团队观察到JNK抑制后CCL2和CCL7显着降低（，J和M）。相反，用BMS-345541抑制NF-κB活性不影响OA软骨细胞中的CCL2或CCL7分泌（，K和N），表明该作用对Inf-A群体是特异性的。ALK抑制剂治疗导致受JNK抑制剂CCL2和CCL7影响的相同细胞因子减少，另外还有CXCL1和CXCL5（，L和O）。

.鉴定OA软骨中罕见的免疫募集群体

FlowSOM算法计算的亚群17和18富含CD24表达（，A和C）。患者之间的丰度差异很大（B）。亚群17和18为炎症抑制（Inf-D）I和II细胞，Inf-D II细胞具有更高水平的CD24、Sox9和CD44表达。CD24+细胞显示出炎症与免疫细胞迁移和相互作用相关途径的富集（D），也显示出氧化磷酸化途径的富集，表明这个亚群可能具有不同的代谢过程（D）。患者明确分为两大类：Inf-D低和Inf-D高的OA患者（E）。与Inf-D-low组相比，Inf-D-high组伴随着高水平的Inf-A亚群（F）。在患者中Inf-α和Inf-D细胞的百分比呈正相关（G）。

一个小而高度可变的亚群19，具有混合特征。亚群19显示IL1R1表达，未显示炎症特征，但却表达CD24。这些细胞仅存在于20名患者中的8名中（I），但进一步表明Inf-D细胞中的CD24表达可抑制炎症。

软骨细胞IBMX刺激后，使用62重Luminex测定，该研究团队观察到CCL2和CCL7的适度下调。然而，这些作用比直接抑制Inf-α信号传导更温和（J）。

该研究团队测试了JNK抑制剂与IBMX的联合治疗48小时。与使用JNK抑制剂的单一治疗相比，该研究团队观察到联合治疗（K）中CCL2和CCL7的降低幅度更大（，J和M）。此外，联合治疗通过减少诸如IL21，IL22，VCAM和IFNB1的靶标的分泌进一步减轻炎症（L）。

.CD24+亚群减轻OA软骨中的炎症

本研究为健康和骨关节炎成人关节软骨建立了第一个单细胞蛋白质组学图谱，并且重新定义了在成人软骨中的软骨干细胞和祖细胞样细胞亚群。同时该研究团队对骨关节炎患者的精确分层将对针对患者亚群的药物进行精准测试，对于建立针对OA的个性化医疗策略具有重要临床意义。