大家好呀！今天跟大家分享一篇2021年6月发表在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（IF:13.751）上的文章。

研究流程：

一、         摘要

背景：近年来靶向免疫检查点治疗转移性黑色素瘤取得了很大成功。然而，预测长期治疗反应的生物标志物还是十分缺乏。

方法：作者使用DNA甲基化数据的无参考反卷积方法开发了基于CpG位点的机器学习分类器，可以将患者分为不同的预后分类簇。DNA甲基化数据使用无参考分析（MeDeCom）和基于参考的反卷积方法（MethyICIBERSORT）进行处理。

结果：作者的研究表明，转移肿瘤组织的DNA甲基化特征可以预测Ⅳ期转移性黑色素瘤患者对免疫检查点抑制的治疗反应。

结论：这些结果表明基于LMC的DNA甲基化数据是靶向免疫治疗患者分类和治疗反映评估的有价值工具。

二、         研究方法

1.ICI队列包括德国三个不同皮肤肿瘤中心（Ⅰ-Ⅲ）治疗的AJCC Ⅳ期黑色素瘤患者，共65例样本（流程图）。从TCGA数据库下载470例黑色素瘤患者的临床数据和DNA甲基化数据，经过滤后得到396例患者的数据。对ICI队列样本进行DNA甲基化测序。

2.DNA甲基化数据预处理和分析

3.TCGA队列和ICI队列的DNA甲基化数据进行无参考MeDeCom算法分析。选择队列中甲基化程度最高的5000个CpG位点输入MeDeCom，得到潜在甲基化成分（LMC）。对LMC比例进行标准化。

4.使用MethyICIBERSORT分析免疫细胞浸润比例。

5.根据MeDeCom得到的5000个甲基化CpGs位点开发患者分类器。

三、         研究结果

1.分析流程和队列统计

为鉴定黑色素瘤患者的DNA甲基化特征，作者首先对DNA甲基化数据进行降维分析，随后进行无参考和基于参考的反卷积分析（流程图）。TCGA队列和ICI队列的KM分析表明AJCCⅠ-Ⅳ期的生存情况不同（A）。突变分析表明，45.3%的原发肿瘤为BRAF突变，25.6%为NRAS突变。40%的患者发生脑转移。

2.整体DNA甲基化分析不能阐明黑色素瘤亚群的特征

作者首先评估整体DNA甲基化模式，CpG位点可能在接受ICI治疗的患者中存在差异。PCA分析表明BRAF/NRAS突变，脑转移状态，放射反应状态与主成分没有显著相关性。

3.无参考MeDeCom分析和有参考的DNA甲基化反卷积算法

由于Ⅳ期的黑色素瘤患者的整体DNA甲基化分析不能揭示与ICI治疗的相关性，作者使用一种无参考算法来评估潜在的预后和预测甲基化特征。因此，作者首先使用MeDeCom算法分析TCGA和ICI队列的DNA甲基化数据。B为8个LMC（LMC1-8）的比例，LMC没有显示出AJCC肿瘤分期的关系。接下来，作者分析LMC比例对TCGA队列的OS的影响，聚类分析有两个主要簇（1 vs 2）（A）。尽管簇1的OS较好，但是并没有明显显著性（B）。接下来，作者使用MehtylCIBERSORT分析细胞比例，簇1中癌细胞比例显著降低，对免疫细胞和基质细胞来说其中CD8+ T细胞，B细胞，NK细胞和CD14+细胞富集于簇1中而CD4+ T细胞在簇1中的比例明显减少（D）。

4.无参考MeDeCom分析表明簇对免疫检查点抑制剂治疗的转移性黑色素瘤具有预测效果

作者对ICI队列的LMC比例进行无监督层次聚类分析（A），其中簇2中DC患者富集程度较高（B）。簇2的患者在接受ICI治疗后的总生存期较长（C），单因素分析表明簇2可以预测ICI治疗后的生存期（D）。MethylCIBERSORT分析表明，簇1和簇2中的癌细胞和大多数免疫细胞亚型没有显著差异，但是调节性T细胞NK细胞和成纤维细胞在簇2中的比例显著降低（E）。

5.基于LMC分类器可以对患者进行分层

最后，基于ICI队列的无参考甲基化分析结构构件患者分类器。作者使用5000个CpGs位点作为logistic回归分析的输入，最终得到20个CpGs位点，根据这20个CpGs位点可以将患者分为生存较好和生存较差两组（F）。该分类器的ROC曲线的AUC为0.9664（G）。

四、结论：

总的来说，作者的研究表明DNA甲基化数据的无参考反卷积分析可以用于癌症患者分层。作者构建的基于LMC比例聚类的预后分析可以用于预测转移性黑色素瘤ICI治疗反应效果。但是还需要额外的接受免疫治疗的癌症患者队列对该分类器进行验证。