基于ATAC-seq和RNA-seq预测子宫内膜非典型增生和子宫内膜样癌患者黄体酮不敏感的潜在模型

子宫内膜样癌(EEC)是妇科最常见的恶性肿瘤之一，每年新发癌症病例和死亡人数呈上升趋势。值得注意的是，EEC及其癌前病变，子宫内膜不典型增生(EAH)呈现出年轻化的趋势，大约一半的年轻EEC和EAH患者在确诊时是未分娩的。因此，保留生育能力的治疗在临床研究中受到越来越多的关注。目前，大剂量孕激素治疗是主要的保守治疗策略，达到约70%-80%的完全缓解(CR)率。然而，仍有大约20%-30%的病例对孕激素不敏感。

目前尚缺乏预测EAH或EEC患者孕激素敏感性的客观指标。研究表明，孕激素受体(PR)在EAH和EEC组织中的阳性表达与保留生育治疗的CR时间较短有关。能用于预测EAH和EEC病例孕激素反应的分子标志物的高质量证据较少。因此，仍然需要进一步的研究来探索预测EAH和EEC患者孕激素反应的有前景的模型。

为了构建EAH或EEC患者孕激素敏感的潜在预测模型，该研究基于EAH和EEC组织的ATAC-seq和RNAseq数据的综合生物信息学分析，确定了候选基因，并在另外35例病例中进一步验证了预测模型。该研究提供了预测EAH和EEC患者孕激素不敏感的潜在模型。

结果：

1. ATAC-seq数据比较PIS与PS患者染色质可及性

ATAC-seq分析基因组染色质的可及性(PIS，n=7和PS，n=7)。每组中有5名患者同时有ATAC-seq和RNA-seq数据。每组中剩下的两名患者分别只有ATAC-seq数据或RNA-seq数据。在ATAC-seq结果中，根据功能和位置信息，每个样本中所有读取的比例与人类基因组中的元素相匹配。PIS组转录位点的可及性在启动子区域更为丰富，而PS组在内含子和远端基因间隔区的可及性更丰富。PIS组比PS组有更多的开放差示峰(D)。通过系统聚类分析，PIS组较PS组有2773个开放峰和948个闭合峰(E)。热图显示，在PIS病例中，转录活跃的基因比例高于PS病例。每组6个样本的基因峰按等级聚类成一组，说明了ATAC-seq数据的可靠性和准确性。

2. 应用RNA-seq技术比较PIS和PS的基因表达谱

为了比较PIS和PS的表达谱，通过层次聚类分析显示DEG(A)。与PS组相比，PIS组有4349个上调的DEG和2102个下调的DEG(B)。GO和REACTOME富集分析确定PIS组中上调和下调的DEG的功能（,C-D）。

BP：PIS组下调的DEGS主要在中性粒细胞相关活性、高尔基囊泡转运、膜内系统组织、巨噬细胞自噬和细胞对化学应激的反应中丰富，而PIS组上调的DEGS主要丰富于膜电位和突触信号相关功能。

CC：PIS组下调的DEG主要集中在颗粒腔、囊腔、细胞-底物连接和局灶性粘连，而PIS组上调的DEG主要集中在突触膜和相关的转运体。

MF：PIS组下调的DEGS富集在钙粘素、核苷、GTP和泛素蛋白连接酶结合等，而PIS组上调的DEG富含通道、跨膜转运体和神经递质受体活性。

REACTOME通路：PIS组下调的DEGS显著丰富于天冬酰胺N-连接糖基化、中性粒细胞脱颗粒、自噬和高尔基体与内质网(ER)之间的转运等途径，而PIS组上调的DEGS丰富于化学和突触信号传递、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和G蛋白偶联受体(GPCR)。

3. ATAC-seq和RNA-seq整合的GO和REACTOME分析

为了进一步确定与孕激素不敏感相关的特定功能和途径，综合ATAC-seq和RNA-seq结果进行进一步分析。通过重叠ATAC-seq和RNA-seq的结果，与PS组相比，PIS组在染色质可及性方面具有138个上调的DEG和92个下调的DEG，其中染色质可及性具有关闭的峰。相关分析表明，上述230个重叠区的表达谱与染色质可及性呈显著正相关（ A,B）

为了进一步了解这230个重叠的DEG是否参与了特定的功能和通路，我们进行了GO注释和REACTOME通路（C-D）。

BP：PIS组中重叠下调的DEGS主要影响细胞的输入运输、半胱氨酸型内肽酶活性的负调节、对活性氧的反应和脂肪细胞分化。

CC：PIS组中重叠下调的DEG位于谷氨酸能突触、膜外成分、含胶原细胞外基质和胞内囊泡腔中，而PIS组中重叠上调的DEG位于糖蛋白复合体、钠通道复合体、β-连环素-Tcf复合体和肌膜。

MF：PIS组中重叠下调的DEG在细胞外基质结合、钙粘附素结合、转录辅因子结合和磷脂酰丝氨酸结合中丰富，而在PIS组中上调的DEG与bHLH转录因子结合、β-连环蛋白结合和钠通道活性相关。

REACTOME通路：PIS组中这些重叠下调的DEG主要影响MAPK家族信号级联、第二信使的细胞内信号转导、PI3K/AKT网络的负调控、G1中的细胞周期蛋白D相关事件以及FOXO−介导的细胞周期基因的转录；而PIS组中上调的DEG主要丰富于胆盐和有机酸、金属离子和胺化合物的运输、微管蛋白的羧基末端翻译后修饰、参与巨核细胞发育和血小板生成的因子以及动蛋白。

综上所述，PIS组中重叠下调的DEGS主要负责信号传递、转录辅因子活性、DNA损伤、细胞凋亡和细胞周期，而PIS组中重叠上调的DEGS主要负责物质转运和细胞骨架蛋白的调节。

4. 孕激素不敏感预测基因的筛选

为了进一步筛选预测孕激素不敏感的候选基因，利用HOMER软件对调节230个重叠DEG表达的潜在转录因子进行了丰富。根据PIS组中69个下调的DEG，确定的TF包括CUX1、TBP、SOX5、FOXJ1、PRRX2、SOX9、FOXQ1、POU1F1、MECOM和NKX2-1，而根据PIS组中76个上调的DEG，仅识别出ZBTB18和CDC5L。此外，根据ATAC-seq和RNA-seq整合的结果，通过HOMER峰分析进行了基序富集化。生成超过20%的具有富含染色质区域的基序的靶序列的已知转录因子(PIS与PS)包括NANOG、TGIF2、NF1、HOXA9、FOXO1、SP2、SOX10、SOX3、TWIST2、SOX6、SOX21、KLF5、MAZ、TCF4、AP-1、BHLHA15R、NEUROG2、ATF3、SOX15和BATF。

此外，使用STRING和Cytoscape软件分析了DEGS编码的蛋白质之间的相互作用(B)。根据连接的品系越多综合得分越高的原则，筛选出潜在的候选基因或中心基因。前四位连接4条以上蛋白质分别由SOX9、CDH2、IRF4和TCF4编码。PIS组下调区有8个蛋白质有4条以上连接线，分别由CD44、ACTB、KLF4、APOE、SNAI2、FYN、PAX2和FOXO1编码。25个候选基因(SYTL2、SOX5、DMD、TCF4、PDGFC、SOX9、BNC2、CDH2、BCL11A、ANKS1B、PPP2R2B、DIO2、IRF4、FGF19、FOXO1、GATA6、IRS2、CD44、APOE、KLF4、ACTB、FYN、CNTLN、HOXA9和RXRA)。

5. 预测孕激素不敏感的潜在模型的建立

为了建立准确预测孕激素敏感状态的模型，将35例患者进一步分为PS-C组(n=13)、sub-PS-C组(n=15)和PIS-C组(n=7)（）。首先，用RT-qPCR方法检测这35例患者中25个候选基因的表达。由于SYTL2、ANKS1B、PPP2R2B和FGF19基因的CT值超过35，表明基因表达水平低，分析不准确，因此这4个基因不包括在后续的分析中。

根据不同孕激素敏感条件，对其余21个基因的归一化ΔCT值进行多项Logistic回归分析，建立预测模型。的结果显示，对于PIS-C患者，总共生成了25个预测模型，预测准确率为100%，其中11个模型对于亚PS-C预测的预测准确率超过80%(P<0.01)。有3个模型的总体预测准确率超过90%，涉及9个候选基因(FOXO1、IRS2、PDGFC、DIO2、SOX9、BCL11A、APOE、FYN和KLF4)。

总结：

ATAC-seq和RNA-seq整合分析共获得230个重叠的差异表达基因。进一步，基于GO分析、反应途径、转录因子预测、基序丰富、细胞角蛋白分析，确定了25个可能与孕激素不敏感相关的候选基因。最后，使用扩展样本进行数据验证，并基于这些数据建立了包含9个基因(FOXO1、IRS2、PDGFC、DIO2、SOX9、BCL11A、APOE、FYN和KLF4)的预测模型，总体预测准确率在90%以上。这项研究提供了潜在的预测模型，可能有助于在保留生育能力的治疗之前识别孕激素不敏感的EAH和EEC患者。