单细胞测序揭示膀胱癌癌症干细胞维持和上皮间质转化

和许多恶性肿瘤一样，膀胱癌的治疗抵抗性和高复发率一直是临床治疗的重要挑战，针对瘤内异质性的分子机制刻画是解决的重要途径。Huanjun Wang等人对13个膀胱癌患者组织、54971个细胞进行scRNA-seq和scATAC-seq，建立了多组学层面的癌症细胞图谱，在鉴定出不同细胞亚群的同时识别到一类癌症干细胞群体，这种肿瘤干细胞群体富集在肿瘤复发期间，EZH2表达升高。作者进一步定义了一种亚群特异性分子机制，通过EZH2维持H3K27me3介导的NCAM1基因抑制，从而使细胞侵袭性和干性转录程序失活。此外，作者同时也阐述了上皮间质转化（EMT）与膀胱癌亚型的相关性。整体上这篇工作为肿瘤干细胞和EMT研究进一步提供了丰富的资源。相关工作Single-cell analyses reveal mechanisms of cancer stem cell maintenance and epithelial-mesenchymal transition in recurrent bladder cancer于2021年9月发表在Clinical Cancer Research (IF= 12.530) 上。

结果一：人类膀胱癌组织的scRNA-seq和scATAC-seq

13位膀胱癌患者按照美国泌尿学会临床病理标准分为三组：4位低复发风险、5位高复发风险和4位复发患者，进行病理切片检查以确定癌症分期。取样后进行单细胞测序，去除低质量细胞之后剩余37000个细胞scRNA-seq数据和17571个细胞scATAC-seq数据。针对scRNA-seq数据使用R-Seurat的CCA方法将不同患者的数据整合分析，通过marker基因表达确定主要的细胞亚群。同样的，在scATAC-seq数据中同样识别细胞亚群并观察marker基因的染色质开放程度。无论是scRNA-seq还是scATAC-seq数据，大部分细胞都是非免疫细胞，通过scRNA-seq方式检测到较高比例的免疫细胞，与之前的研究报道相一致。相比之下，高复发风险患者具有较高的免疫细胞。

结果二：人类膀胱癌非免疫细胞的高度异质性

对CD45-的非免疫细胞进行重新聚类，依据亚群特异的差异表达基因结果聚为17个亚群，包括9个basal细胞亚群、4个上皮细胞亚群、4个成纤维细胞亚群。最近关于成纤维细胞分为炎性成纤维细胞和肌成纤维细胞，作者也依据RGS5和PDGFRA marker基因表达成功分离出这两种成纤维细胞，但是这种成纤维细胞并不是肿瘤特异的，在正常组织当中也同样存在。为了探索这种细胞组成是否能够真实反映肿瘤的分子分型，通过1750个MIBC转录组发现了高度的关联性，并通过TCGA-BCLA数据集在bulk层面利用CIBERSORTx去卷积的方法计算细胞组成，尽管由于样本量不同，但是整体上TCGA-BCLA数据集能够重现scRNA-seq捕获的细胞亚群。

结果三：单细胞测序揭示了复发膀胱癌中富集的异质性的癌症干细胞亚群

通过cancer stem cell 细胞marker CD44和ALDH1A1，在basal亚群中鉴定到两个癌症干细胞亚群，重新聚类则能鉴定到9个亚群，为了理解这种癌症干细胞亚群的异质性，作者分析了亚群特异的差异表达基因，并通过SCENIC toolkit分析了转录因子共表达，结合scATAC-seq数据最终鉴定到EZH2可能是作为癌症干细胞导致复发的关键基因（Figure 3）。在两个EZH2敲低的膀胱癌细胞系中，进一步在体外实验验证了EZH2对于泌尿上皮细胞癌症干性获得的重要性（Figure 4）。

结果四：EZH2塑造细胞粘附和干性基因的表观图谱

作者在野生型和EZH2敲低的细胞中进行ATAC-seq，进一步观察EZH2基因表观层面的关键作用。对EZH2敲低导致H3K27me3峰值丢失约68%，与H3K27me3的代谢活性一致。同时H3K27ac峰值增加了55%，表明的EZH2的关键作用影响。为了明确这种影响机制，作者进行的相关基因的富集分析，涉及细胞粘附、EGFR信号通路、干细胞分化和组织重塑。此外，一些转录因子也会在EZH2敲低之后呈现显著差异表达，例如TCF4、TCFL5和CEBPB，暗示了可能的分子作用机制。

结果五：膀胱癌中独特的上皮间质转化特征

对于肿瘤当中识别到的非免疫细胞——上皮细胞，按照不同的风险分组分别进行伪时序分析，按照伪时序发育轨迹分析差异表达基因，识别出随着伪时序轨迹呈现出共表达模式的基因，包括一些EMT相关的转录因子，例如TCF3、TCF4等。这些EMT相关的转录因子能够直接或间接结合到E-cadherin启动子区域并抑制其转录，进而促进EMT过程。为了进一步获得转录因子调控网络，作者分析了scATA-seq数据并识别到7个亚群，TCF7可能是调控EMT过程的关键因子（Figure 6）。为了进一步验证TCF7，作者通过体外实验shRNA敲低TCF7的表达，结果表明TCF7确实能够起始EMT过程并促进肿瘤生长。

结果六：构建亚型特异的细胞交互网络

为了基因探索细胞类型之间的相互作用，作者使用CellChat方法构建了数据集中的crosstalk 网络，比较了肿瘤微环境和正常组织并进行整合分析，为研究细胞互作提供了中规中矩的分析范式，相关结果在附图中。

小结

作者使用scRNA-seq和scATAC-seq联合分析的方法，分析了13个膀胱癌患者的总共50000个细胞，发现EZH2通过维持肿瘤干性和TCF7促进肿瘤EMT过程而促进肿瘤治疗抵抗和复发，为膀胱癌研究领域提供了非常宝贵的数据资源，同时揭示疾病本身的分子机制，为后续药物开发、临床治疗靶点提供了新的视角。