今天给大家分享一篇2022年9月15日发表在Genome Medicine （IF:15.266）上，新型分子特征识别不良预后且对免疫治疗有独立反应的肾细胞癌混合亚型的文章。

A novel molecular signature identifies mixed subtypes in renal cell carcinoma with poor prognosis and independent response to immunotherapy

新型分子特征识别不良预后且对免疫治疗有独立反应的肾细胞癌混合亚型

一．研究背景

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，其主要组织学亚型为透明细胞癌（ccRCC）、乳头状细胞癌（pRCC）和嫌色细胞癌（chRCC），ccRCC和pRCC起源于近端小管而chRCC起源于远端小管。由于这些亚型肾细胞癌的发病机制、组织学表现、临床进展和结果不同，因此对于治疗方案，必须基于精准的亚型鉴定来确定。

在此，作者利用反卷积算法计算RCC患者三种主要组织学定义亚型（ccRCC、pRCC和chRCC）的分子特征，并开发了一种新的RCC连续亚型分类的方法。该方法将具有不同亚型特征的明确亚型与分子混合亚型区分开来，从而能够检测出具有混合亚型的新一类高危肿瘤。总的来说，这种识别明确和混合亚型的新分类方法为免疫疗法的患者分层和治疗选择开辟了新途径。

本研究共收集并处理了5个独立的RCC队列（1个自产数据集+4个公共数据集），每个队列包含ccRCC、pRCC以及chRCC，包括RCC cohort 1 - C1（18 ccRCC+18 pRCC+16 chRCC）、RCC cohort 2 - C2（74 ccRCC+55 pRCC+29 chRCC）、RCC cohort 3 – C3（512 KIRC+287 KIRP+65 KIRC）、RCC cohort 4 - C4（4 ccRCC+48 pRCC+17 chRCC+23 mixed histology）、RCC cohort 5 - C5（134 ccRCC+86 pRCC+16 chRCC+6 mixed histology）以及2个免疫治疗队列JAVELIN Renal 101 trial（n=726）和IMmotion151 trial （n=823）。对多个队列整合分析，进一步优化了对RCC的分子分型。

二．研究结果

1、建立174 gene signature进行反卷积和分子分型

使用队列C1和C2建立了174个基因的gene signature（每个ccRCC、pRCC和chRCC的前58个亚型特异性基因）。利用这些特征基因，对TCGA-RCC队列（C3）进行了主成分分析（PCA）（A）。主成分1区分起源于远端小管（KICH）和起源于近端小管（KIRC和KIRP）的肿瘤。

2. 按亚型比例分配的肿瘤分子特征

接下来，作者通过亚型比例分配（PSA）来模拟肿瘤的分子特征。他们对来自TCGA RCC队列C3的864个RCC的转录组数据进行反卷积，并计算每个样本的PSA。根据PSA分析发现246（29%）个潜在的异质性肿瘤（B），具有清晰的ccRCC和pRCC共存的肿瘤特征。随后，对来自CCLE和CCLP的RCC细胞系进行PSA分析，明确确认ACHN和CAL54是主要具有pRCC特征的细胞系，而所有其他细胞系主要可归类为ccRCC（C）。

在TCGA RCC队列中，对PSA和标准病理分类进行比较，证实了PSA预测亚型的可靠性（A-D）。并且观察到组织病理学肿瘤特征复杂性与pRCC向ccRCC转变之间的相关性（E）。特别是，具有乳头状特征的ccRCC比明确指定的ccRCC表现出更高的复杂性（F）。

3. FFPE样本的PSA与组织病理学比较

由于队列C1、C2和C3所有样本均是新鲜冷冻组织测序数据。因此，作者评估了PSA对来自FFPE组织的基因表达数据的适用性。如A显示，9个独立肿瘤在配对的FFPE和新鲜冷冻样本中的PSA结果是具有一定可比性。此外，他们还调查了92例FPPE组织（C4），包括4例ccRCC、48例pRCC、17例chRCC、23个肿瘤的混合型组织学分别以ccRCC（n=11）或pRCC特征（n=12）为主，以证明PSA的可靠性（B-D）。PSA分析结果与ccRCC和chRCC的原始组织病理学诊断非常一致。此外，PSA证实了23例混合型肾细胞癌的原始组织病理学诊断，并指定了ccRCC和pRCC的分子特征比例，进一步证实了ccRCC/pRCC特征同时存在的普遍性。

4. 鉴定不良预后的混合亚型

结合ccRCC-score、pRCC-score以及每个样本的风险比分析发现C3队列中肿瘤特异性死亡的最高风险（即具有较大HR值）的样本是表现出ccRCC和pRCC双重特征的分子异质性肿瘤（A）。这些肿瘤基本都位于ccRCC和pRCC肿瘤的主要类之间（B）。然而，少数分散的chRCC和pRCC样本的风险比最低（B）。此外，基于PSA的风险预测可以捕捉到pRCCⅡ型肿瘤内部风险比的异质性（C）。

5. 开发基于PSA的RCC风险预测模型

随后，他们还评估单个ccRCC-score和pRCC-score及其组合模型的预测能力。通过三次多项式建模的ccRCC score，以下简称RCC-R score，在十倍交叉验证中，对不同建模方法的预测精度和模型复杂度进行了最佳权衡。作者还基于RCC-R score计算了预后指数（PI）。此外，基于PI确定了三个风险组：good、intermediate 和poor组（D，E）。

6. RCC-R score验证

在独立队列（C5）中验证了基于RCC-R score的CSS预测，包括134例ccRCC、86例pRCC、16例chRCC和6例已知混合亚型的病例,对C5队列进行反卷积，并计算C5的PI（PIC5）。根据C3中获得的临界值，将C5队列中的样本分为具有预后差异的3个风险组，并且队列C5与队列C3具有一致的预测结果（F）。

随后，通过单变量Cox回归分析显示PIC5与CSS显著相关，表明RCC-R score具有较好的预测效能。最后，将PIC5与临床病理信息例如肿瘤T分期（T）、淋巴结转移（N）、远端转移（M）以及组织学分型一起用于多变量Cox回归模型，PIC5仍然与CSS显著相关，表明PIC5具有一定的独立预后价值。

为了更好地从分子机制上了解上述识别的风险组，作者将其与最近文献报道的分型进行了比较（G-I）。并发现CIMP亚型在poor组中富集（G）。随后，他们还对免疫亚型进一步分析，发现在poor组中，富集了CD8炎症型样本，但在intermediate甚至good的组中也存在CD8炎症型肿瘤（I）。

7. JAVELIN Renal 101和IMmotion 151 trails中PSA与PFS的关系

为了新的分子分型策略对免疫检查点治疗的治疗响应的影响。作者首先对JAVELIN Renal 101（n=726）和IMmotion151（n=823）两个队列的bulk RNA-seq数据进行了PSA分析。并且在两个队列中均发现了具有ccRCC和pRCC共存特征的异质性肿瘤（A、B）。接下来，在两个队列PD-L1阳性肿瘤的患者中，根据指定的ccRCC比例，以95%作为临界值，将样本分为分子异质性亚型和明确亚型。另外，在JAVELIN Renal 101中，与舒尼替尼单药治疗相比，分子异质性PD-L1阳性肿瘤对anti-PD1/PDL1联合酪氨酸激酶抑制剂（axitinib）/贝伐珠单抗（bevacizumab）治疗的反应率更高（C–F）。此外，在JAVELIN Renal 101和IMmotion 151队列中，根据PSA确定的分子异质亚型和明确亚型可显著改善PD-L1阳性肿瘤PFS的预测（C–F）。

三、总结

这篇文章开发了一种新的反卷积算法揭示了RCC的肿瘤异质性，并基于基因表达对不同亚型的单个RCC组织样本进行连续分析分型。从而，发现了具有不同组织学亚型共存的分子特征的肾细胞癌病例。相比于其他聚焦基因水平的分型文章，该研究以明确的ccRCC、pRCC以及chRCC分型为切入点，结合混合亚型样本的特征，区分肿瘤亚型，进行细致的解析刻画，小编认为对于其他具有明确组织学分型的实体肿瘤，可以考虑采用类似的分析方法。