摘要：

目前，二代测序在孟德尔疾病研究中起着重要的作用。然而，由于二代测序读长的限制，其对一些大的结构变异和重复序列的变异所导致的孟德尔疾病无能为力，而长读长的三代测序则可以弥补这些缺陷。本研究对象为一例临床表征为多发性肿瘤和心脏粘液瘤（multiple neoplasia and cardiac myxomata）的患者（诊断为Carney complex，AD遗传模式），在二代测序中未能检出致病位点的情况，采用PacBio single molecule, real-time (SMRT) sequencing技术，成功检测出PRKAR1A基因的exon 1上出现2,184 bp的deletion杂合突变，并根据ACMG判断标准确定其为致病突变。此外，本研究是首次报道应用三代测序仅仅依赖先证者而成功鉴定出致病变异的案例。

研究过程：

1） 二代筛查

对患者进行二代测序，检测SNP和Indel等突变；同时，还采用Pindel，Lumpy， BreakDancer，Manta，CNVKit和CNVnator进行CNV检测。筛选侧重于已知的致病基因，但是并未发现致病变异。

2） 三代测序

采用PacBio系统进行三代测序，测序的平均长度 > 9kb， 测序平均深度为9x。比对采用的软件是NGM-LR v0.1.4，SV检测采用的软件是PBHoney Spots；对数据分析发现了>50bp的6,971个 deletions和6,821 insertions；接着对这些变异进行筛选：（1）去掉位于segmental duplication的变异；（2）去掉与NA12878共有的变异，结果剩下2,476 个deletions和 3,171个 insertions；（3）保留位于编码区的变异，剩余39 个deletions 和16个insertions；其中，3个deletions和3个insertions位于OMIM记录的基因，3个deletions位于CASP8、CD209和PRKAR1A基因，三个insertions位于KALRN、  PAPSS2和PCDH15基因；对这6个候选基因，根据表型信息和遗传模式判断PRKAR1A上的杂合缺失突变可能为致病变异（）。

: PRKAR1A 上的杂合缺失突变：（A）PacBio长读长鉴定2184bp的杂合缺失，4条reads中的2条支持该缺失；该缺失覆盖PRKAR1A的第一个外显子区域；（B）Sanger验证证实该缺失；（C）Illumina短reads也支持该杂合缺失突变

3） 转录组分析

建库是基于冷冻外周血单核细胞进行的。最终纳入分析的样本有1个case和16个controls。采用STAR进行reads比对，RSEM进行基因水平的定量，差异分析采用的软件是DESeq2。结果发现，相对于正常人，先证者的PRKAR1A基因是低表达的；在外显子水平也表现出cases中低表达的趋势，其中以exon2为最；可变剪接分析进一步发现仅在control中表达exon2跳跃的isoform。

：PRKAR1A的RNA测序分析：（A）PRKAR1A基因水平差异表达分析，结果表明在case中该基因是低表达的；（B）PRKAR1A外显子水平差异分析；结果发现组成PRKAR1A的11个exons中，10个在病人中是低表达的，其中第2号外显子低表达的最明显；（C）PRKAR1A的前几个exon的剪切分析，表明和正常人之间有明显差别，特别是exon1和exon3的直接连接只出现在case中。

4） ACMG 标准解读

采用ACMG标准变异位点的解读，该变异被分为致病变异：（1）缺失突变在功能缺失机制已知的基因上（PVS1）；（2）该突变为de novo突变，无家族史(PS2)

参考文献：Merker J D, Wenger A M, Sneddon T, et al. Long-read genome sequencing identifies causal structural variation in a Mendelian disease[J]. Genetics in Medicine, 2018, 20(1): 159.

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