今天分享一篇近期发表在Cell上的研究，该技术创新性的提出多时间点的单细胞测序技术Zman-seq，该技术将时间戳引入循环免疫细胞，并在组织中对其进行长达数天的追踪。应用Zman-seq技术可解析了胶质母细胞瘤免疫微环境失调的细胞状态和分子轨迹，从而促进更有效的免疫疗法的开发。

论文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01317-X

1）背景

我们通常认为癌症是细胞生长失控，但事实上，当你观察肿瘤时，其中很大一部分是由功能失调（被抑制）的免疫细胞组成的，这些细胞有时占肿瘤中所有细胞的三分之一甚至一半。胶质母细胞瘤是免疫抑制作用最强的肿瘤类型之一，要想了解如何战胜这种癌症，我们需要了解免疫细胞进入肿瘤后发生了什么，以及它们为什么会失去对抗肿瘤的能力并变得功能失调。

Zman-seq尝试在细胞还在血液中时对它们进行标记。通过在不同的时间点使用不同的荧光染料，能准确知道每个细胞何时进入组织，在那里呆了多长时间。利用这项技术，可以测量动物模型的不同组织中免疫细胞的时间，如大脑、肺部和消化系统。

：Zman-seq的测序流程

Zman-seq可用于追踪在体内流动的免疫细胞。这种方法通过在血管内注射荧光抗体，对血液中的单核细胞进行染色，并使用一系列不同的荧光染料标记不同的时间点。这种方法可以追踪免疫细胞在肿瘤和其他组织中的动态变化，并可以评估免疫细胞在各种组织中的适应性。此外，这种方法还可以用于研究免疫细胞在不同器官中的状态适应，并排除来自长期组织驻留细胞的标记信号。这种方法的主要优点是特异性高、稳定性好，可以追踪免疫细胞的动态变化，而且标记时间窗口长，可以追踪免疫细胞超过96小时。

2）结果

共检测10583个带有不同时间轴的白细胞，在12，24，36小时各检测一次单细胞，检测结果通过聚类和注释，得到139个元细胞（metacell，后称MC）。每个元细胞包含55-170个细胞（A），针对标志基因，在淋巴细胞和髓系细胞随时间的表达量如B所示这段文字主要描述了Zman-seq技术如何分析肿瘤暴露时间bin（12小时，24小时，和36小时）中的细胞类型分布，并对应特定的细胞状态。为了更好地解析细胞状态，研究者提高了分辨率，并重新聚类了骨髓和淋巴细胞。

发现趋化性（S1pr5+）和细胞毒性（Prf1+，Gzma+，和Gzmb+）NK细胞在早期（12小时）时间点显示出高度富集，而功能失调的NK细胞（Itga1+，Ctla2a+，Gzmc+和Prf1/Gzma/Gzmb-low）在后期（24-36小时）时间点富集-表示Zman-seq捕获了NK对肿瘤信号响应的生物学合理和相关信息（D）。骨髓部分显示出类似的与时间和分化相关的状态变化，其中单核细胞（Ear2+，Ace+，Chil3+和Plac8+）具有早期时间标记，而TAMS（C1qa+，Trem2+和Arg1+）具有晚期时间标记，这与预期的循环单核细胞向TAMs的转变在肿瘤中一致（C和D）。这些随暴露于TME而发生的细胞状态变化与广泛的分子动态相关。例如，在NK细胞中，随着时间的推移，趋化性受体S1pr5的表达减少，而DC的趋化性吸引物Xcl1的表达增加。同样，在骨髓部分，表达高度在单核细胞中存在的Plac8下降，而Trem2的表达增加（E）。总的来说，他们证明了Zman-seq能够解析组装TME过程中细粒度的时间基因表达趋势，从而提供了一种技术来解析肿瘤引发的免疫逃逸机制。

：Zman-seq检测肿瘤微环境中的时间变化特征

Zman-seq还可用于追踪单个细胞在时间上的变化轨迹。该方法克服了大多数单细胞转录组图谱的一个限制，即无法通过实证来定义细胞在时间上的轨迹，而只能进行拟时序分析。作者在GBM模型中进行了高分辨率的免疫细胞状态注释，并利用了时间标记来追踪基因表达轨迹（A）。为了将单细胞时间戳转换为可用于观察分化轨迹的时间轴，作者开发了一种稳健的统计方法，用于在MC级别分配连续肿瘤暴露时间（cTET）值。对于每个MC，可计算了一个基于12小时、24小时和36小时单元格频率的累积分布函数（CDF）（B）。CDF的AUC代表连续肿瘤暴露时间。将AUC轮廓叠加在MC地图上，揭示了随着时间的推移细胞状态的逐渐转变（C）。然后，使用每个注释细胞簇的平均cTET来定义观察到的细胞状态转变下的轨迹（D）。接下来，按照cTET对MC进行时间排序，并确定了与时间最相关的基因（E）。这种方法揭示了响应肿瘤暴露而发生的多个基因表达变化的展开速度不同，包括立即上调的基因，如TGF-β响应基因Pmepa1和Srgn、NK不成熟的标记基因Ccr2和Tcf7、以及Tigit等。上调的TGFβ驱动的Car2和Ctla2a，以前被证明会削弱NK的抗肿瘤活性，紧随其后的是Xcl1和Itga1。Gzmc的表达也随时间上调，这被证明是由TGF-β驱动的，该基因的表达在轨迹的最后阶段迅速增加，这表明胶质细胞瘤 肿瘤微环境中的主要NK暴露生物标志物是TGF-β相关信号模块。表达的归巢受体、细胞因子和细胞毒性分子（Ccl3、Gzmb、Gzma和Prf1）逐渐减少（E）。

为了确定这些转录动态的驱动因素，接下来作者根据dorothea数据库估计了每个MC中转录因子的活动，该分析显示了SMAD3和SMAD4之间在时间上呈负相关。此外，Zman-seq显示SMAD4最初活性高且持续时间长，随后急剧下降，这与SMAD3的活动增加相吻合，后者负责协调TGF-β信号并导致TGF-β印迹的NK细胞状态的出现。

：Zman-seq揭示了GBM中单核细胞向TAM分化过程中的转录变化

之后，研究团队对TREM2拮抗免疫治疗如何影响GBM单核吞噬细胞系统的分化进行了评估。他们使用抗体攻击TREM2，并观察了六只老鼠的肿瘤微环境的变化。其中三只老鼠显示出显著的免疫反应，而另外三只老鼠则显示出较轻微的干扰。研究发现，表达TREM2的骨髓细胞，如巨噬细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞，对TREM2拮抗治疗反应最为强烈。此外，通过Zman-seq技术比较了接受TREM2抗体或控制抗体治疗的老鼠的骨髓细胞，并分析了两种治疗组之间的免疫动态。研究发现，接受aTREM2治疗的老鼠的TAM群体与对照组相比有明显的区别，表现出下调的免疫抑制基因（如Arg1、Pirb、Il18bp、Vegfa和Cd274）和上调的炎症基因（如Ccl3、Ccl4、Cd81和Cd83）。

：TREM2拮抗抗体通过破坏单核细胞-TAM转变来重新编程肿瘤微环境。

该研究还关注治疗引起的细胞轨迹分叉，并分析了轨迹分叉背后的机制。研究发现，控制和aTREM2轨迹的根源相似，都包括未表达Trem2的浸润单核细胞（a，b）。在两组中，初始状态转换都涉及下调单核细胞基因（Chil3和Plac8）（c）。控制aTREM2轨迹在早期和晚期都发生了变化，早期变化包括迅速上调炎症因子Ccl4和Cd81以及抑制控制组中早期出现的免疫抑制因子（如Pirb和Vegfa）的早期上调（d）。在单核细胞衍生的巨噬细胞中，aTREM2引发了短暂的IFN诱导基因模块包括Ifit2和Ifit3的上调（e，f）。通过对比传统单细胞的拟时序分析，可发现Zman-seq在揭示细胞演化过程中的独特能力。

3）总结

Zman-seq使科学家们能够了解免疫细胞和其他细胞进入肿瘤时所经历的精确事件顺序，获取有时间解析度的单细胞转录组信息。Zman-seq在肿瘤免疫学中的应用，阐明了成胶质细胞瘤肿瘤微环境中免疫功能的变化以及治疗干预下的重新配置。

Zman-seq在临床和科学上具有应用潜能，通过将时间维度引入原本静态的单细胞基因组实验的重要性，这提供了一个推断细胞过渡期间因果关系的新思路。通过实际解决细胞状态在时间上的转变，我们才能构建接近现实的动态细胞系统模型，从而更好地理解生理学和疾病。