近年来miRNA研究慢慢陷入低谷期，进入深水区，如果没有特别亮眼的研究，很难冲刺高分。今天就跟着小编一起来看看一篇 2022年2月发表在Molecular Cancer（IF：27.401）上的文章如何“炒冷饭”，将自测数据结合 miRNA signature冲上 27+的，让我们一起解开miRNA研究新套路。

一、研究背景

食管鳞状细胞癌（ESCC）的预后效果较差，原因在于食道中存在广泛的淋巴网络，再加上缺乏保护性血清，导致侵袭性早期区域肿瘤进展和转移，并且在早期阶段，ESCC患者通常无症状，导致诊断延迟。目前尚无临床相关的无创生物标志物可用于食管鳞状细胞癌早期发现。

miRNA已被公认为有前途的非侵入性生物标志物候选，这主要是由于它们的结构稳定性和循环中的丰度。然而，尽管已经提出几种单独的循环miRNA用于ESCC诊断，但它们的临床翻译潜力仍然值得怀疑。

故本研究旨在使用系统的全转录组miRNA表达谱分析，建立并评估了一种基于循环miRNA的标记，用于早期检测ESCC。

作者的研究设计包括五个主要阶段：计算机发现阶段，组织验证阶段，回顾性血清生物标志物优先排序阶段，回顾性血清训练和验证阶段，以及前瞻性血清训练和验证阶段，通过使用 7 个独立、回顾性和前瞻性、跨国、多中心队列整合转录组范围的生物标志物发现和临床验证，建立了一种新颖的、非侵入性的、基于 miRNA 的特征。

二、结果

1、鉴定可将 ESCC 与正常粘膜区分开来的 18-miRNA

在计算及发现阶段，作者使用三个基于组织的全转录组miRNA表达数据集（TCGA ESCC，GSE55856和GSE43732）来发现强大的miRNA候选物。作者评估miRNA是潜在的候选者的标准如下：

（1）在ESCC和正常组织之间差异表达（标准：log2 FC >0.5，FDR调整后的p<0.05）;

（2）区分ESCC和正常标本（标准：AUC>0.7）;

（3）在ESCC中上调，具有相对较高的表达，以利于血清样品中的检测（标准：平均表达>所有差异表达的miRNA的中位平均表达）。

由此从每个数据集中鉴定出癌症组织中明显过表达的miRNA（A-C），并通过overlap分析选出18个候选miRNA（D）。

主成分分析表明，这些miRNA导致ESCC患者和健康个体之间形成不同的簇，这表明这些miRNA可用于区分ESCC患者。

为了评估 18-miRNA 的诊断潜力，作者采用了双管齐下的策略。 首先，在每个数据集中，使用 2 倍交叉验证（重复 100 次）进行多元logistics回归，以证明特征的诊断性能（平均 AUC = 0.98、0.99、0.98；图 2）。

其次，在 GSE55856 数据集上训练了一个多元logistics回归模型，然后将相同的统计模型应用于所有三个数据集，以进一步验证和确认 18-miRNA 特征的诊断性能（AUC = 0.99、1.00、0.99）。

接下来，为了确定这些候选miRNA的功能意义，作者基于从 miRTarBase 数据库 (V8) 获得的经过实验验证的 miRNA-靶标相互作用构建了 miRNA-mRNA 调控网络。总的来说，作者根据以下标准在TCGA数据集中鉴定出393个在肿瘤和正常样品之间差异表达的基因：|log2 FC| > 2和BH-adjust p < 0.01。

2、ESCC患者回顾性队列血清中8-miRNA循环特征的训练和验证

由于作者要开发一种非侵入性液体活检方法，故接下来作者检查了基于组织的18-miRNA组合在基于血清的生物标志物优先排序队列中的转化潜力的诊断性能。在18个miRNA中，与健康对照组相比，ESCC患者的血清中有8个miRNA（miR-103，miR-106b，miR-151，miR-17，miR-181a，miR-21，miR-25和miR-93）在ESCC患者的血清中显着上调（p <0.05，student t-tests）。

由此将研究重点放在8个上调的miRNA候选物。作者首先采用logistics回归推导出风险评分公式，再使用该风险公式和来自血清训练队列的Youden指数（0.582）作为临界阈值，以区分高危和低危人群，通过AUC和相应的95%置信区间，敏感性和特异性评估了该8-miRNA在训练队列中的诊断性能（A）（AUC为0.83（95%CI，0.79-0.87），灵敏度为78%，特异性为75%）。紧接着在另外两个独立的患者队列评估其性能，与血清训练队列一致，循环 miRNA signature在两个血清验证队列中都取得了稳健的表现（B-C）。

接下来，作者使用血清验证队列2，比较了8-miRNA signature与经典的肿瘤标记物——鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)在ESCC患者中的诊断性能。结果表明，8-miRNA在区分所有疾病阶段的ESCC患者方面显着优于SCC-Ag（D）。

上述结果已经证实了8-miRNA对ESCC早期诊断测定的潜力，但其是否对ESCC而不是其他癌症类型具有诊断特异性尚未明确。

因此作者进一步使用公共血清miRNA数据集评估了8-miRNA在其他主要恶性肿瘤（包括结直肠癌，前列腺癌，肺癌和乳腺癌）中的诊断性能。

将8-miRNA的评分公式应用于这些数据集，并评估了每种癌症类型中区分癌症患者和健康对照组的诊断性能。与ESCC相比，其他癌症类型中8-miRNA的AUC值显着降低。

总的来说，这些数据支持 8-miRNA 特征的诊断功效，以及它在检测早期 ESCC 方面的潜力。

3、在两个独立的前瞻性 ESCC 患者队列中验证循环 miRNA 特征的诊断性能

为了验证其临床效果，故作者在两个随机的前瞻性ESCC患者队列中检查了其性能。

作者使用qRT-PCR测定，以评估两个血清标本（分为训练集和验证集）中8-miRNA特征的表达，构建logistics回归分析，结果表明，8-miRNA特征在区分ESCC患者和健康对照的能力方面显著优于单个miRNA（训练集AUC=0.92，验证集AUC=0.93）。

此外作者进行了单变量和多变量分析，以确认循环miRNA特征是检测所有阶段的ESCC患者以及特异性I期患者的唯一重要预测因子。

最后验证了8-miRNA的成本效益。由于I-IV期ESCC患者的诊断风险评分显着升高（所有p<0.001，单侧Student’s t-tests），作者检查了8-miRNA用于识别高级别上皮内瘤变患者的诊断性能。

结果表明8-miRNA能够识别患有高级别上皮内瘤变（n = 13，p<0.01，单侧Student’s t-tests；图 5）。然而，与健康对照组相比，低级别上皮内瘤变（n = 8）或食管炎（n = 6）患者的风险评分没有显着变化。因此循环miRNA特征可能用于早期检测高风险的癌前病变。

三、讨论

在三个基于组织的全转录组miRNA表达数据集中发现强大的miRNA候选物，再采用qRT-PCR评估了候选miRNA的表达水平，构建了miRNA-mRNA网络，使用多变量logistics回归评估其诊断性能，再辅以血清验证队列和临床样本验证，评估其临床效果及进行成本效益分析，采用全面的生物标志物发现过程，这思路也是绝了！

参考文献

[1] Miyoshi, J., Zhu, Z., Luo, A. et al. A microRNA-based liquid biopsy signature for the early detection of esophageal squamous cell carcinoma: a retrospective, prospective and multicenter study. Mol Cancer 21, 44 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01507-x