哈啰大家好！虽然最近挺忙的，但是断更是不可能断更的，任何情况都不可能断更的，所以可爱的我如约而至！~000000000000000000000000000书接上回。上一次我们讲了10X V(D)J测序的原理，还有建库、扩增和测序等过程。今天我们从数据下机的那一刻开始讲起，重点说一下后期对数据的分析处理。10X系统最让人感到开心的地方就是，人家提供前端测序系统和机器的同时，也搭配了一整套完备的后续流程。虽然说是比较基础的分析吧，但简单好上手，使用起来不费劲儿，完成度也非常高。对于无编程和生信分析知识的新手非常友好。对于有生信基础的人来说，更是毫无难度。程序下载页面：https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/downloads/latest 这个页面里包括cellranger V(D)J 分析主程序，可视化工具Loupe V(D)J Browser，还有V(D)J片段用来比对的参考序列，和转录组基因组测序，需要的参考基因组类似。这里多说一嘴，没有下载过10X相关软件的同学们会需要填写你的姓名，工作单位（学习机构）和邮箱，然后才能下载。当然了这个没有一个审核机制，全凭自觉。但是人家软件都免费给你用了，骗人家不好，建议还是老老实实填自己姓名邮箱，不定期还能收到官网新流程和产品的推送，我觉得也挺好的。另外，还有安装页面：https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/pipelines/latest/installation 日常关注咱公众号的同学们应该都……能成功安装软件的叭…？会……有那么一些基础的叭……能看懂安装说明，不需要我再手把手讲……的叭……？我不讲，我累了，我不想讲【很倔强】。我相信你们能行。和单细胞数据转录组分析类似，V(D)J数据也是通过Cellranger Pipeline来进行分析的。如果你非常生猛，数据刚一下机就拿过来分析，到手的格式是BCL格式的，那么你需要和转录组数据分析一样，先运行cellranger mkfastq这个步骤，将BCL数据转化为Fastq格式的数据。具体操作详见网址：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/mkfastq （我可真是送佛送到西的典范）如果你的数据是交给公司测序的，或者别的什么原因，到手的数据格式是Fastq数据，那么恭喜你，你就可以省略上面的步骤，直接进入cellranger的核心流程——cellranger vdj该方法，需要在Linux环境下操作。如上图所示，重要【必须有】的参数有四个，分别是:id：为你的这次分析起一个顺眼的名字。【但也不要太花哨了……毕竟之后你的结果都会存在路径下这个名字的文件夹里……】reference：下载步骤让你们下载的那个reference，记得吗？就是它的保存路径。还有需要提醒的就是，你做人相关的，你就下载人的，你做老鼠，就下载鼠的，匹配的时候可千万别搞错了。fastqs：就是你的V(D)J 数据存储的位置【一定得是fastq格式！】sample：这个不能瞎填，和id不一样。这是标识你数据的。说不明白，我来举个栗子。以官网的示例数据为例。如果你的fastq数据是这样的格式：那么这里，你的sample就应该是【vdj_v1_hs_pbmc3_t_26x91】。也就是说，从【S1】开始往后，是10X系统fastq数据通用的命名格式。这前面的部分，就是标识你的样本信息的部分。把这部分填写进sample参数里面。除了上述的必填项之外，还有几个选填参数，这里也稍微交待一下：这两个参数是对计算资源的限定。即选择用多少核还有多少内存来运行程序。这里如果有服务器集群的同学，我推荐20核，100G内存的配置。这也是10X官方给我的建议。最初我对自己的计算资源过于自信，以致于根本没有care这两个参数，但是程序通常跑着跑着就退出了。后面我和10X官方发邮件才知道可能就是内存设置问题。所以这个参数还是建议大家斟酌计算能力，然后填一下。另外这两个参数我也觉得有必要拿出来说一下。不添加denovo参数的时候，序列会以局部比对的方式，比对到10X官网上下载的参考序列上（就是reference），反之，则是先对reads进行组装，然后再比对。如果你在官方reference之外不指定其他的参考序列的情况下，其实这个参数对结果的影响并不大。另一个参数是对扩增引物的指定。适用于除了人和鼠之外，对其他物种进行V(D)J测序时，可能需要自行设定引物序列。到这里为止，关于cellranger vdj的运行就基本讲完了。下面就是等待运行结果。结果文件会存储在路径设定下以id参数命名的文件夹里。我们需要关注的结果主要分为三部分。一部分是网页上查看的summary文件，另一部分是一堆表格（统计结果和注释结果），还有一堆fasta和fastq文件（序列结果和打分结果），最后一部分是可视化结果。

关于结果的解读，我们下一期再讲吧……

我发誓我下一次一定把这个系列完结！！！一定！！古德拜！~

【我真的不是为了多骗主编稿费……真的不是……】

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