转载自实验万事屋

万事开头难，首先要想个比较牛逼的临床问题出来才好往下编。《持续性交感神经功能活动障碍综合征的环状RNA分子生物学机制》（懒癌差不多只能这样描述了吧），就定这个题目了，随便设计设计吧。

首先要找点跟疾病相关的环状RNA吧，这个倒是不难，去这个网站就可以了：http://gyanxet-beta.com/circdb/

这里包含了一部分和疾病相关的circRNA，搜搜看咯。但是这懒癌要怎么选疾病呢？交感神经功能活动障碍最接近的估计也就是阿尔兹海默症（高级神经活动障碍）了，随便啦，万一真的有关系呢，找几个活体样本来研究一下表达筛选验证一下就行了。那接着我们就按照这个思路，搜一下。

一搜就是一把：

但是点开之后，还是有点不太清楚：

我们再随便点开一个，可以发现，有这么一个环状RNA，但这个具体是啥，还是不清楚，那我们再点开另一个网站：http://www.circbase.org/

搜一下就知道具体基因及序列位置信息了：

但接下来就是关键了，我们有了这些信息要怎么来研究CircRNA呢？检测？要怎么检测？那要怎么研究功能呢？过表达？敲减？好像有点懵是不，我们一步步来设计。

首先我们要知道的是，不管做什么基因的表达什么的，过表达和敲减总是最主要的实验手段，详见柯霍氏法则（点这里）。要证明这个circRNA确实是和持续性交感神经功能活动障碍综合征有关，就必须在疾病模型上进行敲减和过表达。敲减后症状缓解，过表达后症状加剧，就能说明确实是有这样的功能的。

但circRNA的敲减会遇到问题，因为circRNA是剪接异构导致的，就像这样：

也就是说随便的敲减会影响circRNA所在的mRNA的表达，那siRNA敲减的时候，就需要把siRNA的位置选择在形成环状的交界口的位置：

这样就不会脱靶敲掉mRNA了。然而过表达的话，也和普通的不太一样，Natural RNA circles function as efficient

microRNA sponges这篇文献里描述的是这样的过表达结构：

也就是在circRNA基因上下游的位置上分别插入circRNA的上游1kb基因序列，当然，circRNA的3'末端后是倒着插进去的。这样的话就能人工形成circRNA的过表达了，但接下来的问题是，要怎么检测？普通的qPCR就可以检测了，原理也很简单，就是反向设计引物就行了：

那问题又来了，circRNA的功能要怎么去研究呢？circRNA的功能基本上是这样几类：

其实主要作用都是用来作为所谓的Sponge的，也就是结合RNA作为ceRNA的。当然也有时候会结合蛋白，或者本身也会表达一些蛋白。但最容易的就是ceRNA了，那这样研究就简单点了，只要看看相关的miRNA表达和共为ceRNA的mRNA有啥表达差异就OK了。

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