肝内胆管癌（ICC）是第二常见的肝恶性肿瘤。近几十年来，ICC的发病率在全球范围内一直在上升，病因和发病机制仍未完全了解。目前，大约50％的病例仍被诊断出没有任何可识别的危险因素。

Epstein-Barr virus（EBV）与几种消化道癌有关，尤其是未分化的鼻咽癌（NPC）和EBV相关的胃癌（EBVaGC），但是EBV感染与ICC发病机制之间的关系尚未得到很好的证实。

因此，需要系统和深入的了解，以进一步阐明这种罕见的实体瘤，并为发病机理和治疗策略提供有价值的见解。

基于此，中山大学肿瘤防治中心病理科主任云径平教授带领团队使用针对EBV的原位杂交评估了303个ICC ，比较了EBVaICC和非EBVaICC的临床病理参数，分析了EBV感染状态，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和EBVaICC的基因组特征。该项工作以“Clinicopathologic features, tumor immune microenvironment and genomic landscape of Epstein-Barr virus-associated intrahepatic cholangiocarcinoma”为题发表在Journal of Hepatology上。

发表在Journal of Hepatology杂志上

研究方法及结论

免疫组织化学、双重染色、巢式PCR、多重免疫荧光染色、荧光原位杂交、全外显子组测序

1、ICC的患病率和EBV感染状况

在6.6％（20/303）的原发性ICC中检测到EBER（ A）。EBV仅在EBVaICC肿瘤细胞中检测到，而在与肿瘤相邻的周围非肿瘤性胆管上皮中未发现（B）。所有EBVaICC对EBNA1呈阳性，但对LMP1和EBNA2呈阴性，这表明EBV属于潜伏期I型感染（C）。LMP-1 33bp重复的巢式PCR扩增表明，在所有20个EBVaICC中都有克隆EBV分离株（D）。

. ICC的患病率和EBV感染状况

2、EBVaICC和nonEBVaICC在临床病理和预后方面的差异

从组织学的角度来看，在EBVaICC中，ICC的LEL亚型明显比在非EBVaICC中更为常见。EBVaICC（LEL亚型）的2年RFS率为67％，高于EBVaICC（CT）和nonEBVaICC。

分别在45％（9/20）和55％（11/20）的EBVaICC中鉴定出ICC的淋巴上皮瘤样（LEL）亚型和常规类型（CT）（A ）。在所有EBVaICC的LEL亚型病例中，在肿瘤内均发现继发性淋巴滤泡，但在任何EBVaICC CT中均未发现（A）。

与非EBVaICC患者相比，EBVaICC倾向于主要发生于女性（75.0％对37.8％），年轻患者（中位年龄46.5对57.0岁），HBsAg血清阳性率较高（50.0％对26.1％），肝硬化较低背景（5.0％比27.2％），较低的胆石症/胆总管结石率（0％比16.8％），孤立性肿瘤（95.0％比70.7％）和较低的血清CA19-9水平（30.0％比58.0％） （所有p值<0.05）。

. EBVaICC和nonEBVaICC在临床病理和预后方面的差异

3、与非EBVaICC相比，EBVaICC中TIL的密度显着增加

EBVaICC中肿瘤浸润免疫细胞的密度显着增加，包括CD20 + B细胞，CD3 + T细胞，CD68 + TAM，CD8 + T细胞，FoxP3 + T细胞，CTLA-4 + T细胞，HLA-DR + M1 TAM和CD163 + M2 TAM。

. 与非EBVaICC相比，EBVaICC中TIL的密度显着增加

4、在EBVaICC的LEL亚型中，肿瘤浸润的CD20 + B细胞和CD8 + T细胞的比例和密度显着增加

与EBVaICC CT和nonEBVaICC相比，EBVaICC LEL亚型的CD20 + B，CD3 + T和CD8 + T细胞的密度显着更高

值得注意的是，ICC中CD20 + B和CD8 + T细胞密度的增加分别与较长的OS和RFS显着相关。

.在EBVaICC的LEL亚型中，肿瘤浸润的CD20 + B细胞和CD8 + T细胞的比例和密度显着增加

5、EBVaICC具有高PD-L1 / PD-1表达

PDL1-TIL，PDL1-Tumor和PD1-TIL在EBVaICC中显着过表达。总共95.0％（19/20）的EBVaICC呈阳性，PDL1-肿瘤（IRS评分≥3），但只有22.3％（63/283）的非EBVaICC呈阳性（p <0.0001）。PDL1-TILs（IRS得分≥1）的EBVaICCs阳性率为100％（20/20），但非EBVaICCs的阳性率为56.5％（160/283）（p <0.0001）。PD1-TILs（IRS评分≥1）的EBVaICCs总数为95.0％（19/20）为阳性，但非EBVaICCs仅有64.0％（181/283）（p = 0.005）（ A-B）。有趣的是，通过FISH分析在95％（19/20）的EBVaICC中未观察到PD-L1基因扩增（ A）。在所有303 ICC病例中PD-L1和PD-1的IHC表达模式如 C所示。

.EBVaICC具有高PD-L1 / PD-1表达

6、TMIT与ICC中的EBV感染有关

根据免疫组织化学结果，该课题组将每个ICC样品分为TMIT（I，II，III和IV型）：I型，53个样品（17.5％）；II型，123（40.6％）; III型，29（9.6％）; IV型98（32.3％）（ A）。TMIT与ICC中的OS显着相关（p = 0.014），而对于RFS则无显着性（p = 0.059）（B）。TMIT I亚组的生存获益最大，而TMIT III亚组的生存益处最差。

.TMIT与ICC中的EBV感染有关

7、TMIT与ICC中的EBV感染有关

10个EBVaICC的WES数据，其平均覆盖率为100倍，并确定了3353个体细胞同义和非同义突变（包括单核苷酸突变和小的插入和缺失，或InDels）。体细胞突变包括1346个非沉默突变和2007个沉默突变，显示出较高的突变率（中位数：每兆碱基4.4个突变）。该课题组发现至少3例患者的7个基因受到非沉默突变的影响，包括MUC4，DNAH1，GLI2，LIPE，MYH7，RP11-766F14.2和WDR36。通过MuSigCV软件预测了EBVaICC中的22个潜在驱动基因（）。

. TMIT与ICC中的EBV感染有关

8、EBVaICC中的非同义EBV突变

显示了在ICC衍生的EBV中鉴定出的前40个频繁的非同义词突变，这些突变是通过将病毒读数与EBV参考基因组（NC_007605.1）进行比对确定的。所有病例都包含BKRF4，BcRF1（T33A），BKRF4（G169V），BOLF1（D1154E）和BPLF1（S405G）的新热点。

.EBVaICC中的非同义EBV突变

小结

EBVaICC占中国南部ICC的6.6％，其中有EBV潜伏期I型感染和克隆性EBV分离株。EBVaICC在临床病理，肿瘤免疫微环境和分子遗传学方面具有独特的特征。该实体的绝大多数属于TMIT I（PD-L1 + / CD8 -High）。矛盾的是，患者可能对免疫检查点治疗有效。EBVaICC的LEL亚型是宿主免疫应答抗肿瘤活性的理想模型，并且与良好的存活率显着相关，这可能受益于肿瘤浸润性B细胞和CD8 + T细胞增强的局部免疫激活。