Single-Molecule Sequencing in Real Time (SMRT)—单分子实时测序方法 Pacific Biosciences 创新性地提出的新测序方法。Pacific Biosciences 于2004年成立，最初是基于康奈尔大学的一项研究而起步。2010年纳斯达克上市。

仪器设备

1. PaciBioRS, 2010年发售, 仅售于有限的11个客户， 2011年商业发售。2. PacBioRS II , 2013年4月发布，可以测更长的序列reads.3. Sequel system, 2015年9月发布，具有1 million ZMWs, 比RS II更小，但价格只有一半。（据说最近机器刚刚稳定，长度更长，数据量更高）

测序系统

整个测序系统包括PacBio RS仪器以及专利的耗材。耗材部分包括SMRT Cell和试剂盒。PacBio RS上的每个反应消耗一个SMRT Cell。8个SMRT Cell包装成8Pac的形式。试剂盒有三种：模板制备试剂盒，结合试剂盒以及测序试剂盒. SMRT测序主要基于两个重大发明：Zero-mode waveguides (ZMWs, 零模式波导) 和新型核苷酸标记方法。测序是在专利的SMRT Cell中开展的，每个Cell中有一个阵列，上面有15万个ZMW(RS II)。每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条不同的DNA样品链。每次运行能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。ZMWsZMW是一个直径为70nm,深度为100nm的小孔，它阻止可见的激光（波长大约为600 nm）完全透过ZMW。激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮。在每个ZMW中，单个分子DNA聚合酶被固定在孔内。随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。 新型核苷酸标记方法传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。这对于实时观察DNA合成也是有问题的，因为大分子的染料会干扰DNA聚合酶的活性，或造成聚合反应提前终止。因此，Korlach和Turner就开发出一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行标记，而不是碱基，这样，一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，标记基团就会自动脱落。 与二代测序技术相比，特点

 1. SMRT专利技术可以检测单分子2. 不需要PCR扩增，保证了在不同基因区间，GC含量的测序覆盖度一致3. 更长的测序长度, reads长度>10Kb, 一些reads>40kb4. 准确性，单次错误率15%, 循环测序误差8%左右。5. 可以检测出碱基修饰在测序时，可以监测到聚合酶反应的动力学变化，直接对碱基实现测序，当碱基有额外修饰时,DNA聚合酶的合成速度会减慢，对应的信号会被检测出来。原文地址：http://blog.sina.com.cn/s/blog_5c2f929b0102w6ro.html

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