今天来给大家分享一个基于DNA甲基化谱估计肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）丰度的方法——DIMEimmune (Differential Methylation Analysis for Immune Cell Estimation)。该方法于今年五月份发表在OncoImmunology (IF = 5.869)上，通过利用DNA甲基化谱来稳健地估计中枢神经系统（CNS）肿瘤中的浸润淋巴细胞。该方法不依赖于所研究的肿瘤实体中的纯肿瘤细胞的参考signature，可以直接应用于任何CNS肿瘤。

研究背景：

（1）免疫微环境是肿瘤生长和进展的关键因素。随着越来越多的证据表明肿瘤微环境影响治疗结果，免疫疗法对肿瘤免疫学的兴趣越来越大。

（2）肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)已被证实是几种实体肿瘤的重要预测和预后生物标志物。在神经肿瘤学中，TILs主要在胶质母细胞瘤中进行研究，并显示与分子变异相关，如NF1和RB1突变。中枢神经系统肿瘤与浸润淋巴细胞的相互作用在肿瘤的发生和发展中起重要作用，可能与治疗应答有关。

（3）肿瘤浸润免疫细胞的量化方法有多种，比如在苏木精和伊红染色的切片上可以进行TILs的评分，这在乳腺癌、肺癌或胶质母细胞瘤中很常见。同时机器学习方法被用于优化形态学的TIL量化，但对于免疫细胞形态相似的肿瘤（如小圆蓝细胞肿瘤）中该方法就难以实现。

（4）基于基因表达的方法已经成功地用于描述肿瘤微环境，而基于甲基化数据推断微环境信息的方法却很少。而利用分子诊断如甲基化数据来确定浸润程度和免疫细胞亚群表型是值得推荐的。

研究结果：

一、肿瘤浸润淋巴细胞特异性signature的定义：

基本分析内容：肿瘤和淋巴细胞以及外周血中不同免疫细胞群之间的DNA甲基化差异。

数据来源及相关处理:

（1）将来自85个不同实体的2706个样本用来作为不同肿瘤类型的参考；对于免疫细胞，用到了CD4+T细胞和CD8+T细胞的甲基化谱（如a）。

（2）对脑肿瘤和免疫细胞应用不同的t检验统计结果，可得到淋巴细胞特异性CpG位点 (Selected CpGs 1)。考虑到CD4+和CD8+T细胞识别到的特异性位点会具有overlap，作者对来自外周血的免疫细胞群之间的甲基化均值进行了差异甲基化分析和阈值分析，以确定出CD4+和CD8+T细胞的特异性位点 (Selected CpGs 2 + 3)。此外，通过对CD4+和CD8+ T细胞联合组进行差异甲基化分析，计算混合TIL信号。最终选取三组Selected CpGs的交集作为signature。假设Selected CpGs的肿瘤谱的主要方差依赖于于浸润淋巴细胞的数量，通过PCA来对肿瘤队列中的Selected CpGs降维（如b）。

（3）为了验证方法，作者将估计的免疫细胞评分与基于免疫组织学图像的淋巴细胞计数进行比较，同时还与基因表达谱分析得到的signature进行了比较。因此，将训练阶段获得的PCA应用于signature中CpGs的独立测试样本的甲基化值，那么第一组分被定义为对相应淋巴细胞群浸润的估计（如c）。

二、对计算得到的signature进行分析：

（1）作者定义了CD4+ (DIMECD4) 和CD8+ T细胞 (DIME-CD8) 的特异性甲基化signatures，以及肿瘤浸润淋巴细胞 (DIME-TIL) 的混合signature，用来估计对应细胞类型的bulk甲基化谱的浸润量（如a-c）。

（2）为了获得三个signature的详情，并将它们与MeTIL进行比较，作者将它们应用于flow-sorted血液数据（如d）。

（3）接下来进行了基因本体富集来识别与淋巴细胞特异性CpG信号相关的通路 (如表1) 。

三、免疫细胞估计值与免疫组织学结果的验证和比较：

（1）作为第一次验证，作者将基于甲基化的T细胞浸润评分(DIME-TIL、MeTIL和MethylCIBERSORT的T细胞标记之和) 与来自47例诊断病例的免疫组织学图像中的T细胞计数进行了比较（如）。

四、免疫细胞估计值与基于基因表达的结果的验证和比较：

（1）作为第二次校准，作者使用了RNA-seq和基因表达分析的结果。验证数据包括5种类型的肿瘤： 763个髓母细胞瘤(MB)， 129个室管膜瘤(EPN)， 88个非典型畸胎瘤/横纹瘤(ATRT)， 532个低级别胶质瘤(LGG)和64个胶质母细胞瘤(GBM)，这些肿瘤的甲基化和RNA-seq数据都是可用的。

（2）作者将DIMEimmune方法与之前发表的两种甲基化方法(MethylCIBERSORT和MeTIL)的结果进行了比较。与基于MeTIL的估计相比，DIMEimmune在5个肿瘤实体中都具有更好的相关性（如a）。然后将来自MethylCIBERSORT(“CD4_Eff”+“Treg”)的CD4估值和DIME-CD4与基于基因表达的T细胞估值进行比较（如b），DIME-CD8在GBM中具有最高的相关性，但在MB中不具有显著相关，而MethylCIBERSORT方法的CD8 估计值在ATRT中具有最高的相关性，在LGG中的相关性较弱，在MB中具有负相关，其它的都不显著。

（3）最后，将基于甲基化的CD8估计值与基于基因表达的CD8+ T细胞估计进行了比较 (如c)。

总的来说，与之前发表的算法相比，除了在ATRT中对CD8+ T细胞的MethylCIBERSORT估计值以外，DIMEimmune方法与基于基因表达的结果具有更高的相关性。

五、脑肿瘤中的淋巴细胞浸润：

（1）作者使用DIME-TIL估计Heidelberg脑肿瘤分类器的验证集(n = 1104)。和预期一样，最高的TIL评分出现在中枢神经系统淋巴瘤(LYMPHO，如a)。此外，炎症和反应性对照组织(CONTR, REACT和CONTR, INFLAM)中TIL评分较高。

（2）为了更详细地了解TILs在不同脑肿瘤亚组中的分布情况，作者将该方法应用于LGG、GBM、MB、ATRT和EPN的验证数据。结果发现6个胶质瘤实体之间的TIL评分差异非常显著 (如b, p = 1.6e-36)。在IDH(异柠檬酸脱氢酶)突变的少突胶质细胞瘤和IDH突变的星形细胞瘤中浸润估计评分最低，而在间充质胶质母细胞瘤中最高。对于髓母细胞瘤，尽管分子亚组间差异有统计学意义(p = 1.7e-49)， TIL评分总体较低。髓母细胞瘤4组中数目最少，3组中数目最多(如c)。ATRTs显示明显的淋巴细胞浸润。ATRT MYC亚组的TILs明显高于TYR(中间)和SHH(最低)ATRT (p = 0.00012，如d)。室管膜瘤亚组间TIL评分差异显著(p = 4.4e-0.8，如e)，其中YAP和PF B亚组得分最低，PF A和RELA亚组评分最高。

六、 肿瘤浸润淋巴细胞与生存的关系：

最后，作者研究了TIL估计与胶质瘤、MB、ATRT和EPN总生存率之间的关系。在整个胶质瘤队列中，DIME-TIL评分是一个明显的不良预后因素(p = 6.06e-15, HR = 6.26)。然而，在基于甲基化的诊断亚组中，与生存率没有显著相关性(如f)。同样，DIMETIL评分在髓母细胞瘤中也是一个不良预后因素(p = 0.003, HR = 4.3)，但在甲基化定义的亚组中并非如此(如g)。与ATRT的生存率没有显著相关性，可能是由于与其他肿瘤类型相比样本量低(如h)。在有足够的生存数据的室管膜瘤和研究亚组中，TIL评分也与生存无关。(如i)。

文章小结：

该文章基于差异甲基化分析建立了估计CNS肿瘤中CD8+ T细胞(DIME-CD8)、CD4+ T细胞(DIME-CD4)和肿瘤浸润淋巴细胞(DIME-TIL)的方法。以基于免疫组织图像的淋巴细胞计数和基于基因表达的TIL估计为参考，该方法比以往的甲基化相关方法 (DIMEimmune, MeTIL和MethylCIBERSORT) 表现得更好。在淋巴细胞浸润更明显的肿瘤中，估计最可靠。由于它可以应用于任何脑肿瘤实体，因此在即将进行的涉及中枢神经系统肿瘤甲基化数据的研究中，它可以有助于识别TILs作为预后或预测因素。