细胞轨迹分析是单细胞研究中一个常用的手段，今天给大家分享一篇今年三月份发表在Cellular & Molecular Immunology（8.484）上的一篇利用单细胞转录组数据，确定正常个体中自然杀伤细胞分化轨迹，揭示骨髓杀伤细胞的异质性以及急性髓系白血病患者中NK细胞的应激特征的文章——Single-cell profiling reveals the trajectories of natural killer cell differentiation in bone marrow and a stress signature induced by acute myeloid leukemia

单细胞分析揭示了骨髓中自然杀伤细胞分化的轨迹和急性髓系白血病诱导的应激特征

一、研究背景

自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，参与杀死受感染的细胞或者肿瘤细胞。正常人类骨髓中的杀伤细胞可以分为两种——NK1 CD56dim CD16+、NK2 CD56bright CD16- 。其中CD56dimNK1细胞表现出高的毒性，而CD56bright NK2 涉及趋化因子和细胞因子的分泌。

一些研究表明，NK2细胞可以发展为NK1细胞。在造血干细胞迁移后不久，NK2细胞构成主要的自然杀伤细胞群，而在随后3个月，伴随CD56dim NK1细胞水平的升高，CD56bright NK2细胞逐渐消失。而急性髓系白血病（AML）是一种血液系统的恶性肿瘤，AML患者的NK细胞表现出低水平的细胞表面NCR表达，这与细胞毒性受损有关。作者使用8名健康人类骨髓中的NK细胞，探究人类骨髓NK细胞异质性及其分化轨迹，以及8名AML患者的NK细胞探究其与正常个体NK细胞的差异，从而分析NK细胞是如何影响肿瘤发展的。

二、数据及方法

10X的基因组高通量的scRNA-seq数据：

来自8名健康捐赠者骨髓的约24000个NK细胞

来自8名AML患者骨髓的约15000个NK细胞

样本数据;

来自TCGA的161个AML患者的临床数据及表达数据

三、研究的主要内容及结果

1、高通量的单细胞RNA-seq方法识别人类骨髓中NK细胞

使用高通量scRNA-seq测序八名健康捐赠者的骨髓细胞，经流式细胞术分类获取24000个NK细胞。使用gene signature的module score 分析，去除了10个受污染的ILC细胞(A)。接下来，通过UMAP分析将NK细胞聚为4个不同的亚群。其中hNK_Bm4亚群只存在2、3、5号患者细胞（B,C,D)。识别hNK_Bm4亚群和其他三个亚群NK细胞的139个差异表达基因，其中88个下调基因和51个上调基因（E）。下调基因对于NK细胞的发育和分化至关重要，而上调基因参与编码NK细胞相关效应蛋白和细胞成熟（E）。GO功能分析表明hNK_Bm4亚群富集于NK细胞效应功能，例如，NK细胞介导的细胞毒性和凋亡信号（F）。

2、人类骨髓中存在三种NK细胞亚群

从所有细胞中删除hNK_Bm4细胞亚群，进一步描述供者之间骨髓NK细胞的异质性(A)。识别hNK_Bm1、hNK_Bm2、hNK_Bm3三个亚群的转录组特征差异255个基因，绘制三个亚群细胞的热图(B)，通过无监督的层次聚类分析并没有观察到显著的个体特异性和批次效应。在PCA分析中，来自特定个体的NK子集没有聚集在一起，并由此得到三个亚群的驱动基因(C,D)。根据每个亚群中，基因表达水平的高低，提取全基因集中、编码分泌蛋白、细胞膜标记物和转录因子基因集中top10的基因，确定每个亚群的特征。功能富集分析每个亚群参与的生物学通路，进一步揭示3个亚群的转录特异性(E,F)。

3、三种NK细胞亚群包括一个类NK1-CD56dim亚群，一个类NK2-CD56bright亚群和一个额外的类CD56bright亚群

比较确定的三个亚群和以往的NK细胞分型之间的关系，通过gene signature 热图和模块评分分析（A,B,C），以及流式细胞术和不同基因的表达情况（CD160 、CD52、CD122、CD27和CD69）（D,E,F）。确定hNK_Bm1和hNK_Bm2亚型分别类似于NK1-CD56dim和NK2-CD56bright亚型，它们也存在于人类的血液和脾脏中。第三种亚型 hNK_Bm3存在于脾脏而不是血液中，与组织亚型hNK_Sp3最接近。

4. 确定NK细胞分化轨迹的起点——NK0子集

为了探究前面确定的4个NK细胞亚群是否反映了NK细胞不同的成熟状态，作者通过KLRC1基因、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因KIR2DL3和KIR3DL1的表达，确定了hNK_Bm1亚群比hNK_Bm2和hNK_Bm3亚群更成熟，因为细胞表面NKG2A表达的减少和伴随的KIR表达的增加与人类NK细胞的分化有关（A,B,C）。应用伪时序算法Monocle DDRTree寻找骨髓NK亚群的发育路径，4个亚群的伪时序轨迹与先前UMAP定义的亚群完美重叠，为我们之前的结论提供了额外的支持。(D)

通过NK前体细胞（NKP）基因特征，确定假定的发育轨迹的起点（E）。模型评分分析比较骨髓NK细胞亚群中NKP和成熟NK细胞基因的特征(E, F)，hNK_Bm3亚群表现出NKP特征的特异性富集，而成熟的NK细胞中富集hNK_Bm1和hNK_Bm4亚群(E, F)。NK基因签名模块评分的小提琴图也显示hNK_Bm3亚群为最不成熟的细胞亚群(G)。因此，hNK_Bm3子集被定义为伪时间发展轨迹的起点，分别沿着NK1-CD56dim-like hNK_Bm1亚群和NK2-CD56bright-like hNK_Bm2亚群两个不同的发育途径。hNK_Bm4是自适应NK细胞亚群，出现在hNK_Bm1亚群之后的一个时间点。

除了骨髓，作者最近开发的伪时间算法Monocle DDRTree重新分析了之前的脾脏数据(I)。hNK_Sp3子集被认为是最不成熟的，hNK_Sp2、hNK_Sp1和hNK_Sp4子集依次更加成熟(J)。因此，我们将CD56bright-like hNK_Bm3和CD56bright-like hNK_Sp3子集称为NK0。

5. 急性髓系白血病影响人骨髓NK细胞的转录组

急性髓系白血病(AML)是一种与NK细胞功能严重受损相关的特殊骨髓疾病。UMAP分析来自8例AML患者的约15000个骨髓NK细胞，存在11个NK细胞亚群(A)，这些亚群具有很强的患者间异质性——相同患者来源的细胞聚在一起(B)。使用模块评分分析以及基于蛋白质水平检测12名AML样本和7名健康人类的NK细胞中CD56bright和CD56dim亚群的百分比的异质性(C)，表明AML强烈影响骨髓NK细胞的转录组谱。

因此，我们通过分析来自健康捐赠者和AML患者的骨髓NK细胞混合物，进一步研究AML对骨髓NK细胞的影响。对38700个骨髓NK细胞进行UMAP分析显示，NK细胞聚集存在差异(D)。AML供体来源的NK细胞的107个表达上调基因，包括干扰素诱导基因，HLA分子编码基因，编码控制NK细胞成熟和存活。相比之下，健康供者来源的NK细胞的90个基因表达上调显示出更高水平的NK细胞效应分子基因，表面受体基因(E)。以及健康供体骨髓NK细胞中CD160的表达水平高于AML供体骨髓细胞(F)。来自TCGA数据库的AML患者中，CD160高的AML患者的生存率远高于CD160低的肿瘤患者，提示CD160是AML中的抗肿瘤生物标志物(G)。

相对于健康个体的骨髓NK细胞，AML患者的骨髓NK细胞富集在细胞因子应答和I型干扰素信号通路上(A)。相比之下，从健康骨髓中纯化的NK细胞富集在NK细胞介导的细胞毒性、FcγR信号通路、胞外分泌、IL-12和IL -15介导的信号通路应答。总的来说，健康个体来源的NK细胞比AML患者中分离的NK细胞具有更活跃的表型，显示出强烈的I型IFN反应特征。这个结论，也在磷酰十四酸酯和离子霉素的模拟实验中得到验证(B)，并进一步扩展了对NK细胞转录组谱的功能分析(C)。

四、结论：

本篇文章从单细胞转录组的角度，探讨健康个体以及AML患者中，来自人类骨髓中NK的异质性。作者首先在来自8名正常人类骨髓的NK细胞中，确定了4种不同的NK细胞亚群，其中hNK_Bm4亚群有明显的患者特异性。而hNK_Bm1, hNK_Bm2, hNK_Bm3亚群存在所有的正常个体中；并确定了这些NK细胞亚群的分化轨迹。最初鉴定为hNK_Bm3的细胞亚群，高表达CD56、CD52和CD127，且CD160表达较低，不存在于人类血液中，作为NK细胞分化的起点。通过比较AML中NK细胞和正常个体中的NK细胞，确定了AML患者中NK细胞的特异性，以及一个和AML预后显著相关的重要标记——CD160。