Hey, guys~早上好呀！今天小编要跟大家分享的是第一个可以直接从RNA-seq数据识别全长circRNA亚型，并对其表达水平进行量化的方法，名曰psirc，废话不多说，咱们开唠~

一、circRNAs的身世

Firstly，咱们还是先了解一下circRNA的特征、功能等基本资料，已经了解的透透的朋友请自行移步到下一part哈。

1、circRNA的特征

起初，circRNAs被大家认为是错误剪接，直到2012年，Salzman等人利用RNA测序技术发现了circRNAs在不同的人类细胞系中广泛表达。至此，越来越多的研究发现circRNAs在许多生物中普遍存在，表达丰度甚至能够超过同源线性mRNAs；circRNAs的表达模式在不同的细胞和组织类型以及发育阶段也具有特异性；circRNAs的表达、发生机制以及结构特征被认为是保守的；circRNAs分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，因此更加稳定。

2、circRNA的形成机制

根据组成部分，circRNAs大致可分为三种亚型：有一个或多个外显子循环产生的ecircRNAs；由外显子环状化而成，且保留了内含子的EIciRNAs；以及只有内含子组成的ciRNAs这三种亚型。根据circRNAs和临近编码RNA的位置关系又可以将其分为：“exonic”，“intronic”，“ antisense”，“sense overlapping”和“intergenic”。大部分成熟的circRNAs位于细胞质，但也有一些亚型留在细胞核中。

3、circRNAs的功能

circRNA最重要的功能是作为miRNA海绵，与mRNA竞争性结合miRNA，进而调控靶基因的表达水平；circRNA还可与蛋白质相互作用，调节蛋白活性；细胞核中的一些circRNAs, 如EIciRNAs和ciRNAs可以调控基因的转录和剪切; 翻译成多肽或蛋白质；逆转录并整合到宿主基因组中生成假基因；某些circRNAs通过作用于DNA或组蛋白甲基化来影响表观遗传修饰。

二、psirc——检测并量化全长circRNAs亚型

1、是什么？

目前全基因组水平检测circRNAs的通用方法是RNA-seq，由于没有使用polyA富集，得到的数据混杂着线性和环状转录本。从测序数据中识别circRNA的一个重要步骤就是寻找反向剪接位点(BSJs)，现有的方法大多只能识别BSJs，但不能确定具体的转录本，还有一些方法要么只能推断亚型，要么只可以量化表达水平。而psirc方法不仅可以检测全长circRNA转录本亚型，还能够直接利用标准化的RNA-seq数据量化其表达水平。

2、怎么做？

这个方法的流程可以分为三部分，第一步是识别BSJs(.A)，这一步用到了两种信号：junction-crossing reads和last–first exon read pairs，首先作者为所有可能的BSJs构建了一个文库，然后利用pseudo-alignment方法进行比对，junction-crossing是一段覆盖了下游外显子3‘和上游外显子5’端大部分位置的序列，last–first exon read pair则是一对分别与已注释的线性转录本的第一个和最后一个外显子比对上的读段，只有两个读段反向伪比对到同一转录本，才会被筛选。接下来，对于第一步筛选出的每个具有BSJ的线性转录本亚型，研究利用图搜索算法识别了潜在的全长环状转录本亚型(.B)。最后，基于已有研究为所有线性和环状转录本亚型构建了一个T-DBG，根据测序数据的伪比对，通过最大似然函数量化每个线性和环状转录本亚型的表达水平(.C)。

3、怎么样？

东西好不好，比了才知道。作为一篇方法学文章，作者也是用了很大篇幅将psirc与其他方法进行对比。同CIRI2、CIRCexplorer2等其他四种方法相比，psirc对时间和内存的消耗更低，对转录本的定量也更准确一些。然后，为了避免数据偏向性对比较结果造成的影响，作者又重新设计了一个标准流程，同CircAST 、Sailfish-cir、CIRI-full和CIRI-quant等做了对比，结果当然是psirc对转录本亚型的识别和定量更胜一筹了()。

作者又对转录本的实际表达值和不同方法得到的预测值做了相关性分析，结果表明，psirc能够更准确地量化线性和环状转录本()。

换个数据集，结果还是一样()。

最后，文章使用一个包含短读和长读的RNA-seq数据集来评估psirc识别全长circRNA亚型的能力，并跟其他两种方法做对比。总的来说，psirc和isoCirc识别的circRNAs在数量与比例上重叠度更高，它们的关联性也更高()。

4、怎么用？

黑猫白猫，能抓住耗子的就是好猫，跟其他方法的比较结果再好，都不如实例有说服力。于是，作者接下来以11个鼻咽癌(NPC)细胞系和4个正常鼻咽(NP)细胞系的RNA-seq数据为例，去识别BSJs和全长circRNA转录本亚型，并进行定量。结果表明，80%多的BSJs在相关数据库中有收录，新的BSJs也能得到较好的数据支持，此外，线性和环状转录本亚型表达水平的相关性也与已有研究相符。然后，作者筛选了差异表达的BSJs和全长circRNA亚型，通过功能富集进一步识别出癌症相关的circRNA，并发现一些差异表达的circRNA亚型，其表达水平远远高于它们相应的线性转录本，且具有更少的MREs ()。

最后，研究利用RT-PCR和RT-qPCR再一次对结果进行了实验验证()。

近五年来，分析circRNA与癌症关联性的研究越来越多，作为癌症标志物领域的后起之秀，circRNA这幅地图正在被一点点绘制填充，相信随着工具和方法的不断完善，circRNA在疾病的发病机制中所扮演的角色，终将被我们揭示！好了，今天的分享就到这了，have a nice day!

参考文献：

1、Yu KH, Shi CH, Wang B, Chow SH, Chung GT, Lung RW, Tan KE, Lim YY, Tsang AC, Lo KW, Yip KY. Quantifying full-length circular RNAs in cancer. Genome Res. 2021 Oct 18. doi: 10.1101/gr.275348.121. Epub ahead of print. PMID: 34663689.

2、Zhang C, Hu J, Yu Y. CircRNA Is a Rising Star in Researches of Ocular Diseases. Front Cell Dev Biol. 2020 Sep 3;8:850. doi: 10.3389/fcell.2020.00850. PMID: 33015046; PMCID: PMC7494781.