解析癌症的致病机制并识别潜在的治疗靶点越来越受到关注，那么该如何利用生信方法确定关键点，并与实验结合完成一个完整的课题呢？小编今天给大家介绍的刚刚发表在J. Exp. Clin. Cancer Res（IF:12.658）杂志上结合单细胞及组织数据识别食管癌治疗靶点的文章可能会给出答案。

Integrative analysis of bulk and single-cell gene expression profiles to identify tumor-associated macrophage-derived CCL18 as a therapeutic target of esophageal squamous cell carcinoma

组织及单细胞基因表达谱整合分析揭示来自肿瘤相关巨噬细胞的CCL18能够作为食管鳞状细胞癌的治疗靶点

一．研究背景

食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，也是全球范围内排名第六的恶性肿瘤，其中超过90%的病例为食管鳞状细胞癌(ESCC)。此外，ESCC患者预后较差，5年生存率低于30%，且目前只有部分ESCC患者能够从包括免疫治疗在内的治疗策略中获益。因此，迫切需要进一步刻画ESCC的肿瘤微环境、识别早期诊断生物标志物并开发新的治疗靶点。

二．文章摘要

该研究对食管鳞癌活检样本的组织及单细胞转录测序数据进行整合分析，识别了与食管鳞癌预后和肿瘤发生相关的关键细胞亚群和治疗靶点。研究对84例食管鳞癌的肿瘤及配对的癌旁样本的基因表达、功能富集和肿瘤微环境(TME)图谱进行了全面刻画。此外，研究设计并筛选了针对肿瘤相关巨噬细胞来源的趋化因子CCL18的阻断肽，并利用自发性食管鳞癌小鼠模型验证了CCL18阻断肽的抗肿瘤活性。

三．文章的主要内容及结果

1. ESCC的分子特征与细胞生态系统

文章第一部分首先对ESCC的分子特征与细胞生态系统进行了介绍。研究的主要流程如A所示，作者首先识别了ESCC肿瘤及癌旁样本的差异基因(B)，并对这些基因进行了功能富集分析(C，D)。接着研究基于之前的单细胞研究揭示了ESCC微环境的细胞亚群，其中包括上皮细胞(包括非恶性上皮细胞和肿瘤细胞)、免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞、T细胞和B细胞)、成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞(A)。接着研究使用CIBERSORTx基于从scRNA-seq数据推断出的细胞类型表达特征来推断组织测序数据中的细胞丰度(B，C)。研究接着分析了食管鳞癌组织队列中细胞类型的预后作用，结果发现巨噬细胞、成纤维细胞和肥大细胞与食管鳞癌患者不良预后相关(D)。

2. ESCC TME中细胞通讯分析

这一部分研究对ESCC TME中的细胞通讯进行了详细分析。研究使用CellChat从scRNA-seq数据推断细胞间的通信。研究主要分析了细胞因子和趋化因子介导的上皮或肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用。研究首先分析了细胞互作的总数和显著影响的细胞类型(A和B)，结果发现肿瘤样本中互作的数目比癌旁高(C)，且肿瘤中上皮及肿瘤细胞与免疫细胞的信号传导显著增加(D)。

接着研究聚焦于细胞因子和趋化因子介导的肿瘤细胞和TME之间的相互作用。分析首先发现T细胞标志基因CCL5和GZMA，单核细胞标志基因CCL3、CCL3L1和CCL4，巨噬细胞标志基因CCL18、GZMA和DC标志基因GZMB等7个配体的表达上调，可能影响ESCC TME中细胞的浸润和分布(A)。接着观察到CCR1在单核细胞和巨噬细胞中高表达，CCR5在T细胞和单核细胞中高表达，PITPNM3在上皮及肿瘤细胞中高表达( A)。配体-受体相互作用分析还揭示了CCL3/CCR1/CCR5和CCL18/PITPNM3是单核细胞和巨噬细胞中最显著的信号通路(B)。研究进一步观察到上调趋化因子中，CCL18在肿瘤中高表达，且与不良预后相关(C)，而CCL18的受体PITPNM3在上皮细胞和肿瘤细胞中高表达(A)，并与不良预后相关(D)。此外，CCL18-PITPNM3信号是上皮及肿瘤细胞和巨噬细胞之间最强的相互作用(E)。通过免疫荧光染色，研究证实CD68+巨噬细胞(主要是M1型巨噬细胞)中CCL18的表达高于CD206+巨噬细胞(M2型巨噬细胞)(F)。随后，研究分析了CCL18表达水平与ESCC患者的临床病理特征的相关性(表1)，发现CCL18与肿瘤分期显著相关。

3. CCL18作为ESCC潜在治疗靶点的识别

这一部分研究分析了CCL18是否能够作为ESCC的潜在治疗靶点。研究首先分析了多种食管上皮细胞系中CCL18和PITPNM3的表达，结果如A和B所示，研究选择表达PITPNM3而不表达CCL18的食管癌细胞株EC-109进行后续的体外实验，结果如C和D所示rhCCL18可以促进EC-109细胞的增殖，且细胞克隆实验也得到类似结果(E)。接着研究分析了敲低PITPNM3对EC-109细胞增殖的影响，结果发现rhCCL18可以促进EC-109细胞的增殖，但对EC-109 shPITPNM3细胞没有影响(F和G)。此外，研究观察到由rhCCL18介导的JAK2和STAT3磷酸化水平增强可被STAT3抑制剂S3I-201逆转。

4. CCL18阻断肽的设计与识别

这一部分研究对CCL18阻断肽的设计与识别进行了介绍。小鼠体内没有与CCL18相对应的基因，研究发现CCL18与人CCL3之间的序列相似性为62.3%，与小鼠CCL3之间的序列相似性为56.52%(A)，因此研究假设CCL3在小鼠中具有与CCL18相当的效应，因为人类CCL18与人类和小鼠CCL3表现出高度相似的序列和结构(B)。接着研究根据序列比对和结构选择了来自人CCL18和CCL3的潜在功能片段(C)，从CCL18和CCL3的N端和C端选择并合成阻断肽Pep 1-4，结果发现Pep3可以显著逆转rhCCL18对EC-109细胞增殖的促进作用(F)，而Pep1和Pep2只有在200 μM的高浓度下才有效(D和E)。因此研究选择Pep3作为CCL18抑制剂。

5. 阻断肽Pep3在自发性ESCC小鼠模型中显著抑制肿瘤生长

文章最后一部分在小鼠模型中对阻断肽Pep3进行了进一步分析。研究首先建立自发性食管鳞状细胞癌小鼠模型(A)，接着将自发性发生ESCC的小鼠随机分为两组，分别给予Pep3或溶剂，结果观察到Pep3对ESCC小鼠的体重没有明显影响(B)，但可以显著延长小鼠的生存期(C)。此外，Pep3处理显著抑制了肿瘤的进展，导致肿瘤的总长度直径和数量都显著减少(D)，且对CD4+ T细胞的比例没有影响(E)。接下来研究也观察到Pep3能够减少巨噬细胞的总数，但对M1/M2巨噬细胞的比例没有影响(F)。研究也发现Pep3治疗显著限制了食管组织中的肿瘤发展(G)。

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。文章结合组织及单细胞测序数据，对肿瘤及癌旁样本的基因表达和细胞相互作用进行比较，发现趋化因子和细胞因子在ESCC癌变过程中失调，进而识别出肿瘤相关巨噬细胞来源的趋化因子CCL18能够促进肿瘤增殖，导致食管鳞癌预后不良，最终设计出能够抑制CCL18促进的肿瘤细胞增殖的Pep3肽，并在食管鳞癌小鼠模型中进行了验证。文章在数据上整合了组织及单细胞测序数据，在方法上“干湿结合”，内容充实，有理有据，令人信服，十分值得我们参考学习。