小伙伴们大家好，今天又来跟大家分享一篇关于基因调控网络的高分文章，于2021年4月发表在Circulation（IF：23.6）。该文章考虑到动脉粥样硬化的性别差异，构建了女性样本特异的疾病基因调控网络，并识别其中模块的关键驱动基因。本文章分析思路很值得学习，适合我们借鉴到自己的研究中。话不多说，让我们来看这篇文章的主要内容。

Sex-Stratified Gene Regulatory Networks Reveal Female Key Driver Genes of Atherosclerosis Involved in Smooth Muscle Cell Phenotype Switching

性别分层的基因调控网络揭示女性参与平滑肌细胞表型转换的动脉粥样硬化关键驱动基因

一、在动脉粥样硬化样本中的基因共表达模式存在性别差异

为了研究动脉粥样硬化（CAD）中基因共表达模式是否存在性别差异，作者以加权共表达（WGCNA）分析中的连通性来衡量基因共表达模式，并计算了4889个基因的连通性（A）。作者首先计算160名女性样本的连通性（A左侧），随后，取出1个女性样本，加入1个男性样本，重新计算连通性。在A的x轴上，从左到右，女性逐渐被男性所取代，直到达到160名男性。当全部为女性时，连接模式与全部为男性时的连接模式有着较大差异。这表明性别分层对于CAD相关基因调控网络的识别很重要，大多数基因的连接性变化明显取决于研究中男性和女性的比例。之后作者对这些基因进行了K-means聚类（B）。集群1包含男性CAD中更紧密的基因，而集群2包含女性CAD中更紧密的基因。基因富集分析显示，男性集群主要富集在髓系细胞、免疫细胞和血液系统细胞相关通路，而女性集群主要富集于内皮细胞和间充质细胞相关通路。

. 性别是动脉粥样硬化基因调控网络中的关键因素

二、女性CAD的基因调控网络

先前研究已经识别出了CAD相关的基因调控网络， 但作者发现研究基于的样本中90%以上为男性，这就导致结果可能存在性别偏向性。接着作者对这个调控网络分析发现，网络内基因大部分在男性中的表达高于女性，同时网络内基因富集到了免疫应答通路上，这与男性基因集群相关通路一致。

所以就引出了本文章重要的部分，作者在女性样本中利用6676个基因，基于加权共表达方法构建了基因调控网络。一共识别到共表达模块32个，模块大小从26到1261个基因不等，平均每个模块202个基因。

三、优化女性CAD基因调控网络

为了使识别的基因调控网络与临床相关，作者从四个角度进行共表达模块优化：1）网络内基因应该在疾病组织中表达较高（A，B）；2）网络内基因相对于男性来说，在女性样本中表达较高（A）；3）该网络中的基因应该与的CAD临床指标相关（如甘油三酯水平，Syntax得分和葡萄糖水平，C-E）；4）模块中应包含更多与CAD相关的基因（F）。最后得到了3个与CAD临床相关的基因调控模块（黄，蓝和黄绿，G，3A）。

然后作者对这3个模块进行刻画解析。解析围绕两个方面：各模块基因的功能富集分析（B）以及各模块的转录因子预测分析（C）。结果发现各模块与不同的生物学功能相关，受不同的转录因子调控。

. 女性CAD基因调控网络模块优化

. 女性CAD基因调控网络模块刻画

四、女性基因调控网络的有向关系推理与关键驱动因素分析

由于加权基因共表达分析不能推断出网络中节点关系的方向性，作者利用贝叶斯网络算法从加权基因共表达分析生成的共表达模块中推断出有向关系。接下来作者识别每个模块中的顶层调控基因作为关键驱动基因（A）。通过结合基因在疾病样本以及女性样本的表达发现，模块的大多数关键驱动因子在疾病中的表达高于健康组织，在女性样本中的表达高于男性（A）。

五、在单细胞水平下评估女性基因调控网络模块基因的表达模式

为了鉴定这些模块的细胞特异性，作者利用37名患者的人类动脉粥样硬化斑块的单细胞RNA数据分析了关键驱动基因的表达。单细胞数据揭示了18种不同的细胞群，包括炎症细胞和非炎症细胞类型。作者计算了女性调控网络关键驱动因子在这些细胞群中的平均基因表达（B）。这一分析证实了模块的细胞特异性，即来自黄色模块的关键驱动主要在动脉粥样硬化斑块内皮细胞中表达，来自蓝色模块的关键驱动主要在内皮细胞和血管平滑肌细胞（SMCs）中表达，而来自黄绿色模块的关键驱动主要在巨噬细胞中表达。接下来，作者计算了细胞簇中关键驱动因子表达的模块得分，发现蓝色和黄绿色模块的关键驱动因子在来自女性样本的细胞类型中均有较高水平的表达（C-E）。

. 女性CAD基因调控网络模块中的关键驱动基因

六、女性调控网络中关键驱动基因与SMC表型转换

由于蓝色模块富集于肌发生和上皮细胞向间充质转化等生物学过程，并包含SMCs中表达的关键驱动因子，于是作者重点研究了蓝色模块中的关键驱动基因在SMC转化的功能。作者使用最近的单细胞SMC谱系追踪数据来确定蓝色模块中的关键驱动基因是否参与了CAD发展中的SMC表型转变。

蓝色模块中58%的关键驱动基因在SMC的lineage-traced细胞中表达，高于黄色模块和黄绿色模块。在代表传统SMC的Myh11阳性簇中发现13个蓝色模块关键驱动基因，在代表表型转换SMC的Myh11阴性簇中发现9个蓝色模块关键驱动基因，其余11个关键驱动基因在所有SMC衍生簇中表达(A、5B和5D)。当敲除Klf4后，影响了细胞中6个女性调控网络驱动基因的表达（Mfap4、Cnn1、Fn1、Ndrg2、Gas6和Osr1）。Fn1下调，而其他5个基因上调(C和5E)。值得注意的是，Col8a2也存在于SMCs丰富的细胞外基质和成骨簇中，并参与SMC表型转换，在SMC-klf4敲除后下调，但未达到统计学意义。

. 女性关键驱动基因与SMC表型转换

本篇文章的内容就是这些，是一篇非常值得学习的高分文章，让我们来总结下该文章的分析思路。首先作者分析了CAD基因调控网络中性别这一因素，发现性别分层会造成调控网络的差异，而以往的研究使用的样本绝大多数为男性，于是作者想到了构建女性特异的基因调控网络。作者采用WGCNA方法来构建共表达网络，然后进行模块优化，接着用贝叶斯方式来推断网络中的有向关系，进一步来筛选模块中关键的上层关键驱动基因，随之做一些例子的分析。那在我们的研究中，会不会有什么分层因素能够影响我们构建调控网络呢，不如挖掘一下。看完这篇文章后希望大家能够有所收获，学习这篇文章分析基因调控网络的方式。最后祝大家科研顺利，成果满满！