今天跟大家分享的是今年1月份发表在journal of cellular physiology (IF: 4.522) 杂志的一篇文章，这是一篇关于miRNA簇在肝癌中表达的差异以及与预后之间关联的研究。肝癌中19号染色体的miRNA簇与肿瘤负荷和病人预后的联系The chromosome 19 microRNA cluster, regulated by promoter hypomethylation, is associated with tumour burden and poor prognosis in patients with hepatocellular carcinoma miRNA簇通常指的是一类miRNA基因在染色体上成簇排列形成的基因群。肝细胞癌是预后不良的主要恶性肿瘤之一。19号染色体（C19MC）是最大的miRNA簇，C19MC在HCC中的功能和调控机制仍不清楚。作者从TCGA数据库中下载373个HCC样本和50个正常样本。分析了C19MC的表达水平和甲基化水平以及它们之间的相关性。进一步评估了C19MC的表达水平与临床特征之间的相关性。发现C19MC在HCC中表达水平上调，且miRNA的启动子低甲基化。C19MC的表达和甲基化水平之间有显著的负相关性。此外，C19MC的表达水平与T stage等临床特征相关。通过Kaplan-Meier分析，发现3个miRNA（mir-512-1、mir-516a-1、mir-519a-2）与总生存相关。miRNA靶基因的富集分析表明，3个miRNAs的靶基因可能与癌症侵袭相关。综上，该研究表明启动子的低甲基化能上调C19MC的表达水平，C19MC可能作为HCC诊断和治疗的潜在候选标志物。

材料方法1. 数据获取和分析373例HCC和50例正常样本的miRNA-Seq、DNA甲基化和临床数据。使用“edgR”进行差异表达分析。筛选log2FC > 1（此处不理解为何仅仅筛选上调基因）和FDR < 0.05认为是差异表达基因。CpG位点的甲基化水平为β值。对一个miRNA启动子存在多个CpG位点的情况下，计算CpG位点平均值作为miRNA的甲基化水平。对miRNA表达水平和甲基化水平计算spearman相关性。2.  C19MC的生存分析根据C19MC表达水平，对样本绘制KM曲线进行生存分析，评价C19MC表达与OS的关系。将HCC的C19MC表达中位数作为阈值分为两类。生存分析是采用R“Survival”包进行单因素cox回归分析。筛选p < 0.05的miRNA来建立miRNA预后特征。并针对预测模型绘制ROC曲线。3. miRNAs的目标预测和功能分析利用TargetScan、miRWalk和miRDB筛选miRNAs靶基因。并使用“STRING”数据库分析和可视化靶基因之间的PPI。利用“DAVID”在线工具进行基因功能富集分析。 结果1. C19MC在肝癌中的高表达水平从TGCA（文章笔误，应为TCGA）下载373例HCC样本和50个正常对照。使用“edgeR”包筛选差异表达的miRNA。发现C19MC中的所有46个miRNA均表现出上调状态（A）。表明与正常组织相比，C19MC在HCC样品中出现高表达状态。并绘制了miRNA的表达热图（B）。

  C19MC miRNA在HCC高表达 2. 启动子低甲基化导致C19MC上调为了研究C19MC miRNA上调的机制，计算C19MC启动子的甲基化水平和表达水平之间的相关性。使用TGCA（文章笔误，应为TCGA）的甲基化数据。发现HCC样本中的甲基化水平相比正常样本低（A）。为了进一步确定每种miRNA差异表达的影响，这表明所有C19MC启动子的甲基化水平在HCC样品中均显著降低（B），其实和A感觉表达同一个意思，换不同的图进行展示。因此作者推测C19MC miRNA的高表达水平可能与启动子低甲基化有关。接着计算C19MC miRNA表达水平与甲基化水平的Spearman相关系数来评估相关性。发现了C19MC的表达与甲基化水平之间的显著负相关（图S2）。 

：启动子低甲基化导致C19MC上调

 图S2. miRNA表达与启动子甲基化相关性 3. C19MC的高表达水平与组织病理学特征和存活率相关进一步分析miRNA的表达与HCC患者的组织病理学特征和生存率的关联。得到348个HCC样本（缺乏临床信息排除25个）用于分析C19MC miRNA表达水平与临床特征的关系。结果表明，T stage高的HCC病人C19MC miRNA水平较高（）。 

C19MC miRNA表达与HCC的T stage相关。 利用绘制KM曲线，发现在所有46种miRNA中，有3种（mir-512-1，mir-516a-1和mir-519a-2）与OS呈负相关（A）。利用单因素cox分析发现mir-512-1和mir-516a-1以及T stage与OS相关（B）。T stage预后模型的AUC为0.728，与3个miRNA标志一起，AUC值升至0.76。表明3个miRNA对预测HCC患者的OS具有一定的意义（C）。 

C19MC作为预后标记预测HCC生存 4. miRNA靶基因预测和功能分析使用TargetScan，miRWalk和miRDB预测3个miRNA的靶基因，使用“Venny”进行可视化（A）。提取3个miRNA的靶基因的交集。结果发现3个miRNA有196个共同靶基因（B）。对196个靶基因通过STRING数据库识别PPI，设置得分 > 0.9作为阈值构建的PPI网络（C）。 

. 三个miRNA的靶基因预测和PPI分析 5. 目标基因的GO富集和KEGG途径对196个共同的靶基因进行GO分析（A）。KEGG通路富集分析结果如表1所示。进一步分析了MAPK通路中的6个靶基因的表达，发现HCC中的三个基因MAP3K2，MAP2K4和MAPK10的表达下调（B）。这三个关键靶基因位于c-Jun N-terminal kinase (JNK)轴（C）。结果表明三种miRNA可能通过抑制JNK轴的功能来促进肝癌的侵袭，从而影响肝癌的预后。  

. 靶基因功能分析  表1. KEGG富集分析 

好啦今天的分享到这里就结束啦。总而言之呢，该研究使用TCGA的HCC数据来发现C19MC在HCC中呈现出上调，且miRNA是受到启动子低甲基化调控。生存分析发现C19MC的表达水平与组织病理学特征相关。进一步功能分析发现miRNA可能通过MAPK pathway促进HCC的肿瘤侵袭。

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