PCR 引物设计是分子生物学中常用的一项实验技术，对于分子克隆实验至关重要。而 PCR 引物的设计不仅涉及到引物的长度、序列和浓度等方面，还需要考虑引物的特异性和引物之间的互补性等因素。在 PCR 引物设计时，加入酶切位点保护碱基是一种常用的策略。

衍因智研云⇢酶组展示

酶切位点保护碱基是指在设计 PCR 引物时，在引物的一个或多个端部加入与特定酶切位点互补的序列，用来提高后续酶切和连接实验的准确性。这种策略的使用可以帮助 PCR 扩增引入的酶切位点，在酶作用下特异性消化，确保所得到的产物的特异性。

在 PCR 引物设计中加入酶切位点保护碱基，需要根据目标序列的特点和设计需求进行合理的选择。首先，需要确定目标序列上是否存在酶切位点，如果存在，就需要针对特异性扩增的需要选择其中一个酶切位点。

其次，而在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

另外，需要选择适当的酶切位点保护碱基序列，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的 Tm 值和各引物的碱基分布及 GC 含量。如果某条引物 Tm 值偏小， GC% 较低，添加时多加 G 或 C ，反之亦然。

衍因智研云⇢分子克隆工作台

一般而言，酶切位点保护碱基序列通常在引物的末端加入，且长度约为4-6个碱基对。这样设计的引物在PCR反应中，可以在起始温度降低的步骤中与目标序列特异性结合，形成引物-模板DNA复合物，进而加入保护位点。

此外，通过加入酶切位点保护碱基，也可以有效地提高PCR反应的特异性和扩增效率。酶切位点保护碱基可以保护 PCR 产物免受非特异性酶切，避免产生多重带或非特异性产物。同时，酶切位点保护碱基的引入还可以利用酶切位点本身作为分析工具，例如进行界位点分析、分子标记的酶切等。

总之，PCR引物设计时加入酶切位点保护碱基是一种简单而有效的策略。通过合理选择酶切位点和保护碱基序列，可以提高酶切及连接成功率，还可在 PCR 反应时提高特异性和扩增效率，为后续的分子生物学实验提供可靠的实验材料。

附：常用酶切位点保护碱基