无细胞蛋白质表达（CFE）系统已成为体外工程和设计生物系统的一种替代平台，可高通量药物筛选、即时诊断和生物制造。在 CFE 系统中，蛋白质表达的载体通常是环状双链 DNA 分子（如质粒）或线性双链 DNA。这些 DNA 双链通过转录因子来调控转录，从而成为 DNA 和 RNA 聚合酶依赖性的载体。

目前，虽然调控双链DNA表达的方法相对较少，但通过调整转录因子对双链 DNA 的识别和结合已实现了可切换的分子装置。与此相比，基于 RNA 的 CFE 系统越来越受到关注，因为RNA具有丰富的二级结构且可通过操纵杂交和链置换反应来控制。

其中，核糖开关和立足点开关（toehold switch）是最具代表性的RNA类型，允许通过DNA或RNA序列或其他靶分子触发的结构转变来激活或抑制基因表达，但RNA在溶液中的降解和稳定性问题仍然存在。

近日，《Nature Communications》刊登了一篇研究文章，开发了一种可编程的载体——环形单链DNA（Circular single-stranded DNA, CssDNA），其源自 M13 噬菌体，能够被 DNA 和 RNA 聚合酶处理，在基于酵母提取物的 CFE 系统中有效表达蛋白质。

『 01 』CFE 系统中 CssDNA 的基因表达

具体来说，他们将噬菌体载体 pScaf-7560.1 质粒经 Kpn I 和 BamH I 消化，获得包含一个用于 ssDNA 起始的 M13 起点和一个用于终止的突变 M13 位点。随后通过无缝克隆—Gibson组装，将目的基因与pScaf骨架连接，经过测序验证后，在DH5α感受态中扩增。

为了得到 CssDNA，将M13辅助质粒与上述重组pScaf质粒共转化XL1-Blue菌株，摇床过夜后，收集上清中的噬菌体并裂解，得到 CssDNA（图1）。

图1 环状单链DNA的噬菌粒生产示意图，有义/反义质粒的特征，以及相应的CssDNA

为了评估 CssDNA 载体在 CFE 系统中的性能，他们设计了两种类型 CssDNA，都包含 T7 启动子和 EGFP 编码区，其中 CssDNA(+) 编码 EGFP 正义链（图2a，左），而 CssDNA(−) 包含 EGFP 反义链的互补序列（图2a，右），序列如下。

随后，使用琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜（AFM）对 CssDNA 进行了表征，并与相应的质粒进行比较。如图 1b所示，CssDNA 泳道（1605 nt）显示的凝胶带，表明 CssDNA 产物的纯度很高。

CssDNA 的 AFM 图像显示卷曲的结构类似于毛线球，而质粒的结构看起来更拉伸，这是因为单链 DNA 具有高灵活性（图2c）。

图2 CssDNA的表征及其在 CFE 系统中蛋白质表达的调控

之后，他们检测了基于酵母提取物的 CssDNA 蛋白表达和 EGFP 荧光强度。结果显示，无论是CssDNA (+) 还是CssDNA (-) 基因载体，在CFE系统中都可以有效表达目标蛋白（图2d）。

此外，随着时间的延长，两种载体的 EGFP 产量逐渐增加，并达到稳定水平（图2e、f）。CssDNA (+) 和CssDNA (-) 的EGFP荧光曲线相当，但 CssDNA (-) 达到稳定水平所需的时间更短，表明其表达速率比 CssDNA (+) 更快。

『 02 』CFE 系统中不同表达组分对 CssDNA 的影响

为了研究 CFE 系统中 CssDNA 的表达，接下来评估了不同成分对其表达的影响。结果发现，在添加了脱氧核苷三磷酸（dNTP）后，CssDNA 载体的表达显著增加（图1g）。这表明 dNTP 在 CFE 系统中促进了 CssDNA 的基因表达。

另外，还发现添加了 DNA 聚合酶抑制剂阿非迪霉素（Aphidicolin）后，CssDNA 载体的表达受到了抑制（图2h，i）。这表明 DNA 聚合酶的活性对 CssDNA 的表达起着重要作用，这些发现为进一步调控 CssDNA 基因表达提供了基础。

『 03 』CFE 系统中 T7 启动子区对 CssDNA 的影响

为了研究在 CFE 系统中 T7 启动子序列的作用，他们在 CssDNA(+) 和 CssDNA(-) 载体中分别添加了 T7 互补链（图3a）。结果显示，在 CssDNA(+) 中添加 T7 互补链并没有影响表达，而在 CssDNA(-) 中添加 T7 互补链显著增加了蛋白质表达（图3b，c）。T7 互补链对 CssDNA(-) 的表达影响显著，使其蛋白质表达水平增加了三倍。

图3 T7启动子区在CssDNA基因表达中的作用

同时，也比较了 T7 互补链对质粒载体的影响，结果显示 T7 互补链的添加对质粒表达没有影响。此外，当 T7 互补链和阿非迪菌素同时存在时，CssDNA(+) 载体的基因表达受到抑制，而对 CssDNA(-) 载体的抑制效果几乎消失。换句话说，T7 互补链对 CssDNA(-) 的促进作用不受阿非迪霉素的影响。

为了研究不同长度的 T7 互补链对 CssDNA(-) 基因表达的影响，他们又设计了 6 个不同长度的变体。结果显示，不同长度的 T7 互补链对 CssDNA(-) 基因表达都有促进作用，但荧光增强率相同（图3e）。

进一步验证表明，不同长度的 T7 互补链结合的 CssDNA(-) 都能转录出mRNA，而 CssDNA(-) 和 CssDNA(+) 本身的转录能力很小。通过量化转录的RNA量，发现 T7 互补链长度减小会降低 CssDNA(-)+T7 的转录能力。

同时，还发现与 CssDNA(-) T7 启动子外的其他区域互补的 DNA 链对基因表达无影响，只有包含部分 T7 启动子序列的 DNA 链会增强基因表达（图3i）。因此，在CFE系统中添加与 T7 启动子互补的 DNA链 是调控 CssDNA(-) 基因表达的有效方法。

『 04 』CFE系统中CssDNA载体的基因表达途径

综合上述结果，不难发现 CssDNA(+) 和 CssDNA(-) 载体的表达过程与 DNA 合成有关。然而，CssDNA(-) 载体的表达途径与 CssDNA(+) 有所不同，可能涉及直接的转录机制。

为了验证这个假设，他们设计了一系列实验，使用不同浓度的 CssDNA 载体，并检测相应的 EGFP 表达情况。在实验中，他们使用了阿非迪霉素抑制 DNA 复制以及 T7 互补链模拟 DNA 复制的方法来模拟 CssDNA 表达中间过程，使表达途径更加明确。

图4 两种CssDNA载体在CFE体系中的基因表达过程

结果显示，在 CssDNA(+) 载体中，随着载体浓度的增加，EGFP 的产量最初增加，然后减少。当载体浓度为 2ng/μL 时，EGFP 产量达到最大。然而，当 CssDNA(+) 载体浓度高于 2ng/μL 时，蛋白质表达降低，可能是由于资源共享效应的影响，即缺乏 DNA 合成底物来生成完整的双链DNA。

而添加阿非迪霉素会破坏 DNA 聚合酶活性，干扰单链 DNA 转化为双链DNA，因此无论 CssDNA(+) 载体浓度如何，蛋白质产量都显著降低。这表明在 CssDNA(+) 复制产生不完整环状双链 DNA 时，其表达可以忽略不计。

此外，还发现，无论向 CssDNA(+) 载体中添加任何浓度的 T7 互补链，都对 CssDNA(+) 基因表达没有显著增强作用。这与之前的结果一致，在T7互补链和阿非迪霉素共存下，EGFP 的产量与单独存在阿非迪霉素时一样低。

这些进一步证明了通过 DNA 复制完成的双链 DNA 合成是 CssDNA(+) 载体基因表达的必要条件，随后是 mRNA 转录和蛋白质翻译。换言之，CssDNA(+) 的蛋白质表达需要完整的互补链作为转录模板，似乎是 CssDNA(+) 基因表达的唯一途径。

『 结语 』

总之，这项研究不仅为合成生物学提供了新的基因调控工具，也为理解和利用单链 DNA 在生物系统中的行为提供了新的视角。通过 CssDNA，研究人员能够设计出更为复杂和精细的基因调控网络，这对于开发新的生物技术和生物医学应用具有重要意义。