概述PCR克隆，即将PCR产物捕获到目标载体中的过程，以及如何在衍因智研云软件中执行这项技术。

什么是PCR克隆？

PCR克隆是指将PCR产物插入到一个目标载体中。插入PCR产物主要有两种基本方法：

1.利用PCR产物内部已有的，或是在引物中引入限制性内切酶位点，通过特异性酶切连接，插入到目标载体中；

2.利用TA或TOPO载体，这些载体使用较少的中间步骤就能将PCR产物插入到目标载体中。

利用限制性内切酶克隆PCR产物

一种简单的PCR产物克隆策略是利用序列中已存在的限制性内切酶识别位点，这种方法受限于目标序列中预先存在的限制酶位点及其与所选载体的相容性。

衍因智研云质粒图谱中的限制性酶切位点

此图展示了在智研云质粒图谱中唯一的限制性酶切位点，若要克隆完整的基因，您需选择相应的酶切位点，并在PCR产物中同时存在，才能通过酶切连接最终将PCR产物插入目标载体中。

此外，当载体插入区域和PCR产物酶切位点不一致时，可以在PCR引物设计时，引入目标载体插入区域附近的限制性酶切位点，便于后续实验中酶切连接。

大多数限制性内切酶在位于片段末端时切割效率不高，通常需要间隔3到5个相邻核苷酸，为酶的特异性结合提供足够的空间，以达到最佳酶切效果。一个比较方便的经验方法是，在您选定的限制性酶切位点之外再添加一个额外的限制性酶切位点。

在衍因智研云中为PCR克隆添加限制酶位点

一旦您成功地使用选择的限制酶位点引物扩增得到了PCR产物，接下来需要遵循典型的限制酶克隆步骤来完成操作。

具体步骤包括：

    1.PCR扩增：使用在引物上添加了所需限制酶位点的引物，扩增您的目标片段。

    2.对您的PCR产物和载体进行性限制酶切。

    3.对插入片段和载体进行凝胶纯化。

    4.之后进行连接（ligation），接着进行转化、筛选，并完成克隆周期的剩余步骤。

PCR克隆中限制性内切酶作用示意图

无限制性内切酶克隆PCR产物

TA克隆和TOPO-TA克隆是两种常用的PCR产物直接克隆方法，它们不需要进行限制酶位点扩增。这两种方法能够通过最少的步骤直接克隆PCR产物。虽然特定载体可能需要单独购买或制备，但是有许多可供选择的TOPO和T/A载体，其中一些能够让你快速完成实验。

什么是TA克隆？

大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3′末端添加一个非模板依赖性的“A”，而T载体是3′带有一个“T”的载体，在连接酶作用下，完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。

T/A克隆和限制酶克隆的原理类似，都是使用DNA连接酶将插入片段和载体连接在一起。不同的是，T/A克隆没有限制酶位点的限制，插入片段可以以任意方向连接到载体上。这种方法在选取克隆进行测序时可能会遇到困难，因为插入片段可能存在反向连接的情况。另外，T/A克隆的连接稳定性不高，因为连接的两端只有单一的T/A碱基，容易发生断裂。此外，根据所使用的连接酶，连接反应可能需要好几个小时。

TA克隆

什么是TOPO克隆？

TOPO TA克隆是对标准TA克隆的一种改进，它使用了拓扑异构酶I。拓扑异构酶I可切断DNA链，并将切割的末端通过旋转使其重新连接，缓解DNA分子中的过度缠绕。这种方法可以有效地解开DNA的超螺旋结构，并使插入片段更容易与载体进行连接。

在实验室中，我们经常使用拓扑异构酶来处理线性化的TOPO载体。这种拓扑异构酶会在载体的两端预先装配，并且具有切断和重新连接DNA链的能力。当我们提供合适的DNA片段时，拓扑异构酶和载体之间形成复合体，并完成DNA链的重新连接。这一步是实验中的最后一步，以确保插入的DNA片段能够成功与载体连接。

因此，TOPO克隆通常非常高效，而且没有背景噪音。TOPO反应仅需5分钟的培育后即可进行转化。

此外，TOPO载体还能让您克隆平末端的PCR产物，或是通过定向TOPO克隆将插入片段以特定方向克隆进载体中。

TOPO克隆

克隆PCR产物的关键技巧

除了在设计与操作PCR过程中讨论的良好基本PCR习惯外，还有一些其他特定要点需要铭记于心。

1.选择最佳的PCR酶

碱性 Taq 聚合酶每复制 10,000 个碱基对就会引入一次错误。突变随着每一轮扩增而积累，因此，在30轮扩增结束时，每轮复制数百万个碱基对，找到未突变产物的几率不到十分之一。

市场上有多种PCR酶，其保真度比传统Taq聚合酶高20倍或以上，推荐在进行克隆PCR时使用这些酶。此外，将PCR循环次数控制在最低，不超过30轮，就可以降低突变风险。

2.选择最佳载体

在进行克隆PCR产物时，有多种可选的载体可供使用。这些载体通常会根据特定的目的进行预配置，例如用于蛋白表达纯化或构建Gateway入门克隆等。另外，还有一些载体功能相对简单，主要用于将PCR产物插入其中的多克隆位点(MCS)。在选择载体时，我们应该考虑未来可能的需求，这样可以节省时间和成本上的投入。

3.PCR产物纯化

大多数情况下，纯化DNA片段可以提高克隆反应的效果。常见的PCR产物纯化方法是使用PCR纯化柱，它可以高效地去除酶、盐分和剩余的dNTPs。但需要注意的是，使用PCR纯化柱可能无法完全去除引物、模板或错误的片段。因此，在选择纯化方法时，应根据具体需求和实验目标进行综合考虑。

在选择纯化方法时，可以考虑使用凝胶纯化作为替代方案。凝胶纯化是利用琼脂糖凝胶将PCR片段分离出来，然后进行纯化步骤，与使用PCR纯化柱相似。不同的是，凝胶纯化只纯化目标片段，因此可以更加精确地选择所需的DNA片段。这也是一种常见的PCR产物纯化方法。

4.定量你的片段

在进行克隆实验时，通常需要准确地定量所使用的DNA量。如果选择使用凝胶来定量PCR反应中的DNA量，常规情况下不需要进行纯化步骤，但这取决于后续实验步骤是否需要纯化产物。另一种常见的定量方法是使用光谱法，如使用Nanodrop进行定量。但如果使用该方法，则需要在纯化PCR产物之后进行，因为核苷酸和核酸聚合物具有类似的吸收特性，可能会干扰定量结果。

5.务必对克隆的PCR产物进行测序

在进行克隆实验时，即便使用高保真度的DNA聚合酶，也不能保证产物完全没有突变。因此，建议对克隆PCR产物进行测序以验证其序列的准确性。在订购PCR引物时，应提前考虑到序列验证的需要，并同时订购可能需要的其他引物。如果PCR产物较长，建议预先订购每隔500碱基对一次的测序引物，以便对整个产物进行测序分析。