掌握聚合酶链式反应（PCR）的基本原理。

什么是PCR?

聚合酶链式反应（PCR）是全球实验室中应用最广泛的分子生物学方法之一。通过热循环和耐高温DNA聚合酶的应用，PCR能够对特定的DNA序列进行指数级扩增。

这一反应是由凯利·穆利斯（Kary Mullis）于1983年首次开发此技术，并在1985年与同事首次将这一技术应用于扩增β-球蛋白基因。穆利斯在《酶学方法》出版物中对该方法进行了更为详尽的描述，后来因为其在此方面的贡献，荣获了1993年的诺贝尔化学奖。

PCR所需的5个关键组分如下：

1.DNA模板
2.引物
3.DNA聚合酶
4.dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）
5.反应缓冲液

DNA模板

无论是单链还是双链DNA，都是PCR的标准模板。DNA来源包括基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）或质粒。

引物
PCR引物通常设计一对上下游引物，分别称为正向引物和反向引物。这些引物与单链DNA的互补区域相结合，一旦结合到靶标区域，PCR引物就可在DNA聚合酶作用下延伸新序列。

DNA聚合酶
PCR中常用的聚合酶类型被称为Taq DNA聚合酶。该聚合酶得名于其最初提取的嗜热菌——水生栖热菌（Thermus aquaticus），Taq聚合酶能在高温下高效工作。

您可以在下方了解更多关于DNA聚合酶的特性。

dNTPs（核苷酸）
为了在PCR过程中生成新的DNA链，必须具备四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）碱基——腺嘌呤（ATP）、胸腺嘧啶（TTP）、胞嘧啶（CTP）和鸟嘌呤（GTP）。

反应缓冲液

PCR反应缓冲液包含了成功进行反应所需的基本成分，其中包括DNA聚合酶辅助因子镁离子（Mg2+），有助于聚合期间dNTP的结合，可以为聚合酶提供最佳工作条件。

PCR的工作原理是什么？

一个典型的PCR过程包含以下步骤：
第一步：预变性
第二步：变性
第三步：退火
第四步：延伸

变性、退火及延伸（步骤2至4）构成了PCR循环，这一循环会重复多次以增加最终PCR产物的数量。

步骤1：预变性

双链DNA首先被加热至约94°C，持续几分钟。高温破坏了双链互补碱基之间的氢键，从而形成两条单链DNA。

DNA模板越大，预变性阶段所需的时间就越长。例如，相比于cDNA，基因组DNA（gDNA）含有更多的碱基和氢键，因此需要适当延长gDNA预变性时间，确保双链DNA完全解离。

（要复制的序列）

步骤2：变性

在每次PCR循环开始时，样品会被加热至94°C左右，这个过程只有几秒钟。这个步骤能够确保新形成的双链PCR产物重新变性为单链形式。

步骤3：退火

随着目标模板变为单链形式，样品随后温度降至45–60°C，从而使PCR引物与其在模板上的互补区域退火结合。
确切的退火温度因引物长度和GC含量等性质而变化。例如，长度较长的PCR引物通常需要较高的退火温度，而较短长度的引物所需的退火温度则较低。

步骤4：延伸

接下来将样品加热至72°C，这个温度是Taq聚合酶能够从已结合引物的3末端开始延申合成新的DNA链的最佳温度。

在延伸步骤结束时，PCR产物的拷贝数相比于PCR循环开始时会翻倍。

PCR延伸

随后PCR循环（步骤2至4）会重复进行，通常循环30至40次，增加PCR片段的拷贝数量。在每一次循环后，产物拷贝的数量都会翻倍。这意味着经过30次循环的PCR反应可以从一条模板扩增得到超过10亿倍的产物！

DNA聚合酶：四大关键属性

目前市面上有多种不同类型的DNA聚合酶可供选择，每种都有自己独特的性质。因此，在考虑PCR应用时，需关注聚合酶的四个关键属性：

1.热稳定性
2.特异性
3.延申合成能力
4.保真度：衡量聚合酶在复制DNA过程中引入错误的频率，即复制准确性。

在某些情况下，为了优化热稳定性、特异性、延申性和保真度的要求，可能更适合使用不同聚合酶的混合物。

热稳定性

由于热循环是DNA扩增重复链式反应条件的关键特征，因此，所使用DNA聚合酶的热稳定性非常重要。尽管最初来自于嗜热菌菌株的 Taq DNA 聚合酶可耐受相对较高的温度，但是其半衰期在90°C以上时明显缩短。当使用 长时间高温 使具有二级结构和富含GC序列的DNA变性时，这一缺陷便成为一大难题。同样，在扩增长片段模板时，需要更大量的Taq DNA 聚合酶或补充Taq DNA聚合酶，以供长时间孵育。因此，从超嗜热菌分离的DNA聚合酶具有更高的热稳定性，将有助于克服这些挑战。

Pfu DNA聚合酶是一种为大家所熟知的超耐热酶，来自于水热环境中的超嗜热古细菌 Pyrococcus furiosus 。在95°C下，Pfu聚合酶的稳定性能比 Taq 聚合酶高20倍。其它常见的超耐热DNA聚合酶包括来自古细菌 Thermococcus 和 Pyrococcus 的KOD和GBD，其中GB-D的超嗜热DNA聚合酶Deep Vent，在98–100°C下的半衰期可达数小时。

尽管古细菌DNA聚合酶的热稳定性极强，但它们在某些方面也具有一定局限性。例如，超耐热 Pfu DNA 聚合酶的合成能力较低（与 Taq DNA聚合酶相比），因此合成DNA的速度较慢，这就需要延长延申时间。此外，古细菌DNA聚合酶无法扩增含有尿嘧啶的DNA模板，因为其存在尿嘧啶结合区域作为一种DNA修复机制。含尿嘧啶的DNA序列是 防止PCR 残余污染 和经亚硫酸氢盐转化进行 基因座甲基化分析 的基础。

特异性

非特异性扩增是PCR反应最主要的障碍之一，因为它会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。而DNA聚合酶经常会延伸错配的目的基因和引物二聚体，这是非特异性扩增的常见来源。如何减少非特异性扩增？第一张方案是在冰上配制PCR反应，这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平，但在PCR开始之前依然可能会合成不需要的产物。

提高DNA聚合酶和PCR特异性的另一种方案是使用热启动Taq。热启动Taq混合物通常包含一种与抗体结合的DNA聚合酶，这种抗体在低于90°C的温度下抑制Taq的活性。在PCR的初始变性步骤中，高温会使抗体从聚合酶上解离，从而激活Taq酶。接下来，样品将被加热至72°C，这个温度提供了最佳的延伸条件，使Taq聚合酶能够从已结合引物的3末端开始合成新的DNA链。因为只有在90℃以上的预变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。

聚合酶延伸合成能力

聚合酶的延伸性是指单一酶在从DNA模板上脱落之前能连续掺入的核苷酸数目。

在75°C条件下，天然Taq聚合酶通常能够以每秒10到45个核苷酸的速度扩增DNA，也就是说大约每分钟扩增2千个碱基！

有的DNA聚合酶经过工程化改造改善了其DNA结合结构域，使其比传统的Taq聚合酶更加稳定。例如，KAPA2G聚合酶的速度约为每秒掺入150个核苷酸，比Taq聚合酶高出3倍。

提高聚合酶延伸性能对于扩增长片段PCR产物（例如大于10千碱基）是有益的，还有助于推动反应向富含GC碱基对的DNA区域或具有高度二级结构的区域延申。

保真度

保真度指的是DNA聚合酶准确复制目标模板而不会掺入错误碱基的能力。

先前对Taq聚合酶的分析表明，其总体错误率为1.8 x 10^-4，这意味着由Taq聚合酶掺入的每10,000个碱基中，至少会出现1个错误（包括碱基替换、缺失、插入等）。Taq聚合酶的保真度相对较低与其缺乏3'至5'外切酶校读功能有关。

高保真DNA聚合酶，具备基于 3′ → 5′核酸外切酶校正活性，可校正错误插入的核苷酸。DNA聚合酶上的核酸外切酶活性位点与其5′→ 3′聚合酶活性位点是分离的。当错配的核苷酸插入聚合结构域，DNA合成将因不合适的碱基配对动力学而暂停。暂停期间，DNA聚合酶将切除错配的核苷酸并用正确的核苷酸替换。

对于需要精确克隆长序列的PCR应用，建议使用高保真度聚合酶。像Pfu和Q5®这类聚合酶，具备校读活性，其保真度比Taq聚合酶高出1至2个数量级。

聚合酶链式反应（PCR）的应用

PCR是一种多用途的技术，已经在许多分子生物学应用中得到利用，包括：

1.克隆
2.突变体产生
3.基因型分析
4.基因表达分析

克隆

多种克隆方法都在采用PCR技术来直接或间接地重组DNA片段。

直接PCR克隆方法包括TA克隆、GC克隆以及TOPO®克隆。这些方法能够直接克隆PCR产物。其中，TA克隆法利用了Taq聚合酶介导的PCR反应完成后，在产物末端形成的3’A突出，这种黏末端能够与含有3’端T突出的DNA片段（如线性化载体）进行重组。

在间接PCR克隆中，PCR产物在与其他DNA序列重组之前需要进行修饰。一种常见的修饰方法是在PCR引物设计时，引入限制性酶切位点，通过对PCR产物和目标载体进行酶切，从而实现与载体的重组。通过这种间接PCR克隆的方法，可以实现对特定DNA序列的快速、高效的克隆。

突变体产生

PCR突变体产生是一种用于生成定点突变的技术，例如碱基置换、插入和删除等。

举个例子，如果想要通过突变来产生单个碱基的变异，通常会设计一对包含所需突变碱基的PCR引物。突变位点一般位于引物序列的中间。然后使用这对突变引物和高度保真度的DNA聚合酶进行PCR反应，在反应过程中突变位点会被插入到目标序列中，最终形成所需的突变序列。

在衍因智研云软件中，您可以设计诱变引物并模拟突变体产生反应。

基因型鉴定

等位基因特异性PCR是一种用于检测序列变异的方法，可以确定生物体的基因型。

对于等位基因特异性PCR，引物设计用于侧翼目标区域。例如，在创建基因敲除小鼠时，引物用于靶向野生型和转基因基因区域。然后，您可以通过分析琼脂糖凝胶上的PCR产物来确定敲除实验是否成功。

使用衍因智研云，您可以模拟琼脂糖凝胶电泳，预测PCR及限制性酶切后产物带的数量和大小。

基因表达分析

聚合酶链反应(PCR)最普遍的应用之一是通过定量PCR(qPCR)进行基因表达分析，也称为实时PCR(RT-PCR)。

在两步法qPCR中，首先将含有信使RNA(mRNA)转录本的RNA通过反转录转化为互补DNA(cDNA)，随后，得到的cDNA作为模板用于qPCR。PCR引物被设计用于扩增感兴趣基因的转录本片段。在qPCR过程中，通过对荧光信号的实时监测来检测转录本的扩增情况，该荧光信号进而被用来确定目标基因的初始表达水平。

在两步法qPCR中，首先将含有mRNA转录本的RNA进行反转录，将其转化为cDNA。随后，以得到的cDNA作为qPCR的模板，并设计用于扩增目的基因转录本的PCR引物，进行扩增。在qPCR过程中，通过实时监测染料法或探针法的荧光信号，来检测转录本的扩增情况，并据此确定目标基因的初始表达水平。

使用衍因智研云，您可以设计引物并模拟PCR实验来规划qPCR实验。

PCR类型

有一些技术是对传统PCR方法的改变，包括重叠延伸PCR和反向PCR。

重叠延伸PCR

重叠延伸PCR，也称为通过重叠延伸剪接，是一种多用途的技术，通常用于在无缝反应中将多个DNA片段融合在一起。
该反应分为三个独立的PCR步骤：延伸、重叠和纯化。
延伸PCR：引物对在相邻DNA片段间引入重叠末端
重叠PCR：延伸PCR的产物随后用于另一次PCR中，以连接重叠的PCR产物
纯化PCR：结合至首个和最后一个DNA片段末端的引物用于新的PCR中，以扩增融合产物

通过使用诱变引物，重叠延伸PCR也可用于引入定点突变。
衍因智研云能协助您设计用于重叠延伸PCR的引物并模拟该反应。

反向PCR

反向PCR用于通过使用与常规PCR引物反向相反的引物，扩增与已知序列相邻的未知DNA序列区域。

反向PCR的一个应用实例是克隆未知序列。一段DNA区域，其中包含一段已知序列，已知序列两侧为未知序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子。环化后，利用已知序列区域的引物进行反向PCR，得到的PCR产物可随后连接到克隆载体上，进行分离及测序。

PCR实验成功技巧

防止污染

PCR是一项非常敏感的技术，容易受到诸如gDNA等非目标核酸的污染。
以下是一些简单的方法，可帮助您减少PCR污染的可能性。
1.在每次PCR实验之前，使用脱氧核糖核酸清除剂（如DNAZap™）清洁移液器和工作环境。
2.准备PCR混合液时使用PCR级水。
3.使用带有防气溶胶滤器的吸头。
4.将工作区域分开为不同的区域；在一个房间配置PCR混合液，在另一个房间吸取模板。
5.将PCR试剂和PCR引物分装成工作体积。
6.避免将PCR试剂和移液器用于非PCR相关的实验。

配置PCR主混合液

在涉及多孔反应的PCR实验中，一个非常有用的策略是准备包含DNA聚合酶、反应缓冲液（如dNTPs、盐类等）和引物的主混合液。主混合液可以在一个单独的管中配制，然后等体积分配到每个反应孔中。接下来只需向每个孔中加入所需的模板即可。通过采用这种方式，可以提高实验的效率并减少潜在的误差来源。

主混合液确保了PCR各组分在不同孔之间均匀分布。相比于将每种组分单独移液到每个孔，使用主混合液还可以节省时间。

为了应对在准备主混合液时可能出现的移液误差，建议制备比实际需求多10%的混合液。例如，如果需要准备100个孔，建议制备足够110个孔的主混合液。这样可以确保有足够的混合液可以使用，避免因移液误差导致不够的情况发生。

使用梯度PCR确认最佳退火温度

在使用衍因智研云等计算工具设计PCR引物时，可以计算出估计的引物熔解温度（Tm）。进而，可以根据引物的熔解温度估算PCR的退火温度。

预估的退火温度会因为所用的DNA聚合酶而有所不同：

多数DNA聚合酶：退火温度一般比引物熔解温度低0-5°C

具有校正功能的DNA聚合酶（例如Phusion®、Phire®、Q5®）：退火温度比引物熔解温度高6-12°C

当然，这是理论上的PCR退火温度。还有其他因素可能影响反应的退火温度，比如引物浓度和反应缓冲液的组成。因此，对于新设计的引物对，在优化退火温度时建议使用梯度PCR。

梯度PCR是指在相同的PCR循环条件下，通过在不同样本孔之间改变退火温度来实现不同反应条件的PCR。大多数热循环仪都配备了梯度功能，可以在不同样本孔之间设置不同的退火温度。在进行梯度PCR时，建议设置的温度区间应该包含预估退火温度上下5°C的范围。这样可以确保在不同样本孔中都能够寻找到最适合的退火温度条件。

确保DNA模板溶液中不含PCR抑制剂

在提取和准备用于PCR的模板DNA时，要确保其不含可能抑制PCR反应的化合物。

模板溶液中常见的PCR抑制剂包括：

1.蛋白质
2.乙二胺四乙酸（EDTA）
3.乙醇
4.离子型去垢剂（如十二烷基硫酸钠[SDS]）

避免添加过多模板

向PCR中添加过多的DNA模板实际上可能会抑制反应。因此，应根据DNA类型调整模板的添加量。

以下可作为决定PCR中DNA模板添加量的参考：
cDNA：1–100 ng
基因组DNA：5–50 ng
质粒DNA：0.1–10 ng
请切记，PCR是一种非常灵敏的技术，因此通常来说，添加比预想中更低浓度的DNA模板会更安全，而不是过量添加。